禽流感病毒HA1基因的克隆及原核表达*
周雪媚1，霍惠玲2*，张 飚3 ,李永清4，王连群5
（1.中国农业大学动物医学院，北京 00094；2.河北省兽药监察所，河北石家庄 50051；3.河北农业大学动物医学院，河北保定 71000；4.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 00089，5.邯郸市动物检疫站，河北邯郸 56001）
摘 要：用RT-PCR方法扩增出禽流感病毒A/Muscovyduck/Fujian/2/2000（MF00）株部分HA基因，大小约900 bp，将其克隆到pMD18-T载体上，并进行了序列的分析。通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将HA基因亚克隆到原核表达载体pGEX4T-3上，成功构建了阳性重组表达质粒，并将阳性重组质粒转化BL21（DE3）菌株。经IPTG诱导表达，结果禽流感HA基因在pGEX4T-3系统中得到高效表达，经Western blotting检测证实表达产物有生物学活性。
关键词：禽流感病毒；HA1基因；克隆；原核表达
禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的一种禽类传染病，几乎所有的野生及家养禽类都可发生。近年来，该病在国内许多地区暴发，造成巨大的经济损失，严重威胁着我国养禽业的发展。尤其是2004年春季高致病性禽流感（H5N1）的暴发流行，不仅对养禽业造成巨大的经济损失，而且对人类的生命健康带来很大的威胁[1-4]。
一般认为，鸭（特别是野鸭）是AIV的自然宿主，AIV在其体内存在且不表现任何临床症状，但可以向环境排毒而感染其他易感禽类，引起发病而死亡。鸭体内自然存在的AIV主要以H1、H3、H4亚型居多，但近年来也有H5亚型的出现。陈化兰等[4-5]报道了1999年－2002年中国大陆南方及沿海省市健康鸭体内存在大量的H5 AIV，这些病毒虽然不引起感染鸭的死亡，但对鸡呈高致病性，鸭作为流感病毒的自然带毒者不仅对养禽业，而且对人类也具有巨大的潜在威胁。
AIV为正黏病毒科A型流感病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8个不同功能的蛋白，其中血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白是病毒囊膜纤突的主要成分之一，在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用，刺激机体产生的中和抗体可中和病毒的感染力，是宿主的主要抗原。成熟的HA是一个由548个～552个氨基酸残基构成的多肽链，在病毒的复制过程中，被细胞内蛋白酶切割为HA1和HA2两个亚单位决定它能否感染细胞,而血凝素的抗原性主要集中于HA1上[6-7]。
本试验以鸭源AIV HA1基因为目的基因，构建了含HA1基因重组表达载体，并在大肠埃希菌高效表达HA1融合蛋白。通过Western blotting印迹验证了抗原抗体的结合能力,为HA1基因表达蛋白作为诊断抗原用于鉴别诊断奠定了基础，为预防AI的暴发提供有力的依据。
1 材料与方法
1.1 病毒株和SPF鸡胚
AIV毒株为A/Muscovyduck/Fujian/2/2000（MF00），由福建农科院黄瑜研究员赠送，SPF鸡胚购自北京市实验动物中心。
1.2 质粒载体
pGEX4T-3由本实验室保存。克隆载体pMD18 -T购自Takara生物工程公司。
1.3 试剂
DNA回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自北京道普生物技术开发中心，工具酶及限制性内切酶均为New England Biolabs产品；PCR反应试剂、DL 2 000和λ/Hin dⅢ、DNA Maker购自Takara生物工程公司；DNA回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自北京道普生物技术开发中心。
1.4 引物的设计与合成
根据GenBank发表的AIV基因的序列及4种表达载体多克隆位点的分析,设计了1对引物，上游引物：5′-GGATCCAT GTGCATTGGTTAC-CAT- 3′，下游为5′-CTCGAGTCCAGTCGAAGGACTAA-3′。并分别在上游引物和下游引物5′端引入Bam HⅠ和XhoⅠ；上述引物由博亚生物工程公司合成，预期扩增片段长度为900 bp左右。
1.5 病毒的扩增及RNA的提取
将种毒经10-2稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，培养24 h~48 h后收毒，用Trizol试剂进行尿囊液总RNA提取。具体操作按试剂说明书进行。
1.6 RT-PCR法扩增HA基因
RT反应在10 μL反应体系中进行，加入5×缓冲液2 μL，dNTP 1 μL，RNA酶抑制剂0.25 μL，反转录酶(AMV-RT)0.5 μL，H2O 4.75 μL，下游引物0.5 μL，模板1 μL，扩增参数为：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。RT产物进入PCR反应，PCR反应体系如下：按50 μL反应体积配制，吸取4 μL cDNA，5 μL l0×PCR buffer，1 μL dNTP，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶5 U，补足水至总体积50 μL。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，以下按94 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.7 PCR产物的克隆、酶切鉴定及序列分析
将PCR扩增出的900 bp的片段克隆到pMD18-T载体中，并命名为T-HA1。通过酶切分析和PCR鉴定出含HA1基因的阳性重组质粒。由上海博亚生物工程公司完成对目的基因的测序,应用DNAStar6.0软件对其序列分析。
1.8 原核表达质粒的构建
将重组质粒T-HA1和pGEX4T-3载体分别以Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切，8 g/L的琼脂糖凝胶回收目的片段、连接、转化感受态BL21（DE3），并涂于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养平板37 ℃培养过夜。重组质粒经PCR和双酶切鉴定。
1.9 HA基因特异片段的表达
将经鉴定为阳性的重组菌菌液接种到含氨苄青霉素的ＬＢ培养基中,在37 ℃以120 r/min培养2 h～5 h,当细菌达到对数生长期(ＯＤ600=0.5左右)时加入ＩＰＴＧ至终浓度1 mmol/Ｌ,继续培养4 h～6 h。收集菌液,应用超声波破碎,加入ＳＤＳ上样液,煮沸3 min,用ＳＤＳ-ＰＡＧＥ电泳检测表达情况。
1.10 重组蛋白特异性鉴定
表达产物经SDS-PAGE电泳后，通过电转印将凝胶上的蛋白条带转移到NC膜上。然后以SPF鸡的AIV阳性血清为一抗，HRP标记兔抗鸡IgG为二抗进行Western blotting分析。
1.11 重组蛋白血凝活性的鉴定
表达产物主要以包涵体形式存在,用3 g/L SKL(N-十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体,经微量离心机12 000 r/min,2 min，收集上清液，上清液再经透析使蛋白质复性。复性后的蛋白质用生理盐水稀释后，加入等体积5 mL/L的鸡红细胞，室温作用30 min，观察结果。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果
根据设计的特异性引物对AIV毒株的基因组进行了RT-PCR，扩增出约900 bp的DNA片段，与预期大小相符，并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序，测序的结果与GenBank上的H5N1株欧亚种系同源性都很高，达到96%以上，说明HA基因克隆正确。
2.2 HA基因的重组表达载体的构建
通过Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切位点将HA基因克隆到表达载体pGEX-4T-3上，获得了阳性的重组质粒（图1）。对阳性重组质粒进行了PCR和双酶切鉴定，结果表明，HA基因已经克隆到表达载体pGEX-4T-3上。
2．3 目的基因表达和SDS-PAGE分析
用120 g/L的SDS-PAGE检查表达产物，发现pGEX-4T-3空载体产生26 ku的蛋白条带，而HA-4T-3则出现大小约60 ku的条带（图2）。重组蛋白的表达量随时间的延长而增加，在诱导6 h后表达量达到高峰。计算机分析结果显示，其表达量约10.0%。
3.DNA 标准DL 2 000；4.HA1-4T-3双酶切（Bam HⅠ、XhoⅠ）；
5.HA1-4T-3 Eco RⅠ单酶切（BamHⅠ）
1.Negative control；2.Products of HA1 gene by RT-PCR；3.DNA marker DL 2 000；4.HA-4T-3（BamHⅠ、XhoⅠ）；5.HA1-4T-3（BamHⅠ）
图1 禽流感HA基因的扩增与克隆
Fig.1 Amplification and cloning of HA gene of AIV
1,2.分别为诱导前的HA和pGEX-4T-3；3. 诱导6 h后的空载体；4～6.分别为诱导2，4，6 h后的HA；7.预染的蛋白分子质量标准
1,2.HA and pGEX-4T-3 uninduced; 3. pGEX-4T-3 being induced for 6h; 4-6.HA being induced for 2，4，6 h;7.Prestained protein marker
图2 SDS-PAGE分析HA融合蛋白
Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein HA
2.4 重组蛋白特异性鉴定
用SPF鸡的AIV H5N1阳性血清对HA-pGEX-4T-3菌体蛋白进行Western blotting分析。结果显示HA的表达产物与AI阳性血清发生反应，于60 ku处出现一清晰的反应条带，表明重组蛋白在大肠埃希菌中得到了正确表达并保留了免疫原性（图3）。
图3 重组蛋白的Western blotting 结果
Fig.3 Western blotting results of recombinant protein
2.5 重组蛋白血凝活性鉴定
重组蛋白用生理盐水稀释后与鸡红细胞作用，结果显示HA的表达产物没有凝集鸡红细胞活性。
3 讨论
HA分为两部分，重链HA1和轻链HA2，HA1和HA2通过二硫键相连形成HA单体，单体间通过共价键结合，在病毒囊膜表面形成1个三聚体。HA基因全长序列为1.7 kb,其中包括HA1长约1 kb，HA2基因长约0.6 kb，在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽约0.05 kb。在目的基因的选择上，考虑到HA1是主要抗原基因，而HA2基因和信号肽序列的疏水性可能会影响到重组蛋白的分泌表达以及表达蛋白的可溶性，因此选用鸭源AIV HA1作为目的基因。
在已有的基因表达系统中，大肠埃希菌表达系统具有成本低廉，操作简单，容易培养，生产周期短，易于获得高水平表达的蛋白，并且表达的蛋白易于纯化等优点而备受基因工程研究人员青睐。大肠埃希菌表达方式包括融合表达和非融合表达。由于融合表达不但可以减弱内源性细菌蛋白酶对外源基因表达蛋白的破坏作用，提高目的基因的表达水平，提高表达蛋白的抗原性，有利于表达产物的纯化。本实验选用鸭源AIV H5N1的HA1基因作为目的基因，构建了重组原核表达载体pGEX-4T-3-HA1， 对重组蛋白的表达条件进行了优化，使目的蛋白获得了较高水平的表达，同时研究了重组蛋白的免疫活性，为HA1基因表达蛋白作为诊断抗原并用于鉴别诊断，为预防AI的暴发提供科学的依据。
参考文献（略）