奶牛铜绿假单胞菌的分离与鉴定*
张耀相1
，邱 立1，曹振莲2
，张彦明1*
（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵712100；2.柞水县畜牧站，陕西柞水
711400）
摘 要：从奶牛颈部脓肿中分离出一株革兰氏阴性杆菌，经生物学特性研究和生理生化试验鉴定为铜绿假单胞菌。该菌对小鼠有很强的致病性，药物敏感性试验对氟哌酸、氧氟沙星、先锋必等抗生素高度敏感；对庆大霉素、氨苄青霉素、链霉素等抗生素有耐药性。
关键词：铜绿假单胞菌；分离；鉴定；奶牛
铜绿假单胞菌(Pseudanonas
aeruginosa，Pa)亦称绿脓杆菌，广泛分布于土壤、水和空气中，亦常存在于人和动物的皮肤、肠道和呼吸道，当机体抵抗力降低或皮肤和黏膜受损时，可引起全身或局部感染，导致多种动物的脏器脓肿。近年来国内报道从患病的奶牛、鸡和貉的病料中分离出了铜绿假单胞菌[13]。我们从奶牛颈部脓肿中分离出一株革兰氏阴性杆菌，经生物学特性和生化试验鉴定为铜绿假单胞菌。该菌对小鼠有很强的致病性，对多种药物有耐药性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 普通营养琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、普通肉汤、普通斜面及部分生化试验培养基均按文献[4]方法配制。部分生化试验用糖发酵管(批号：20060414)和药敏纸片(批号：20060519)均购自杭州天和微生物试剂公司。
1.1.2 小鼠 体重为20
g～25 g小鼠8只，购自第四军医大学实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离 用无菌注射器从奶牛颈部脓肿中抽取脓液，制成抹片并对其进行革兰氏染色和光学显微镜观察；同时，接种普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，37
℃ 24 h温箱培养。挑取可疑菌落移植到普通斜面4 ℃～8
℃保存，15 d传代。
1.2.2 生物学特性试验 将可疑菌落分别接种普通平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、普通肉汤，37
℃ 24 h温箱培养，观察生长表现，并进行革兰氏染色，分别观察形态特征。
1.2.3 生化试验 用分离菌纯培养物进行糖发酵试验，按文献[4]方法进行。
1.2.4 药物敏感试验 将普通肉汤24
h培养物进行比浊计数，用无菌生理盐水稀释为4×108
cfu/mL均匀涂抹在培养基(MuellerHinton，MH)上，然后用灭菌的小镊子夹取药敏片放于培养基上，均匀放置，密度不宜过大。放入37
℃恒温箱中培养24 h后观察并测量抑菌圈的大小。
1.2.5 动物致病性试验 用37
℃ 24 h肉汤培养物浓度为24×108 cfu/mL注射4只20
g～25 g小鼠，分别进行腹腔注射、皮下注射，观察发病情况。
2 结果
2.1 生物学特性
该分离菌为革兰氏阴性中等大小杆菌，散在或4个～6个排列成链状，无芽孢，有菌毛，能形成荚膜。在普通培养基中呈圆形、中等大小菌落，光滑、湿润，边缘整齐，隆起，后期产生绿色色素，培养基中有绿色色素渗透，菌落呈现深黑绿色。在鲜血琼脂平板培养48
h后为β溶血，大菌落，边缘整齐，凸起，湿润，深灰色菌落。在麦康凯琼脂平板上菌落中等大小，呈圆形，光滑，整齐，表面湿润，边缘整齐，无色。
2.2 生化试验结果
分离菌的生化试验结果见表1。
表1 分离菌株生化试验结果
Table
1 The results of biochemical test of
isolated bacteria
|
项目 Items |
结果 Results |
项目 Items |
结果 Results |
|
接触酶 Catalase |
＋ |
L阿拉伯糖
Lpectin sugar |
－ |
|
吲哚 Indole |
－ |
D木糖Dxylose |
－ |
|
甲基红 MR |
－ |
山梨醇 Sorbitol |
－ |
|
VP Vogesproskauer |
－ |
木胶糖 Wooden gum sugar |
＋ |
|
L树胶醛糖Lgum
aldose |
－ |
D果糖
Dfructose |
－ |
|
柠檬酸盐 Citrate |
＋ |
麦芽糖 Maltose |
－ |
|
鸟氨酸脱羧酶 Ornithine decarboxylase |
＋ |
蔗糖 Sucrose |
－ |
|
精氨酸脱羧酶 Arginine decarboxylase |
＋ |
棉籽糖 Raffinose |
－ |
|
松三糖 Loose trisaccharicle |
＋ |
半乳糖Galactose |
－ |
|
卫茅醇 Dulcitol |
－ |
明胶 Gelatin |
＋ |
|
甘露醇 Mannitol |
＋ |
葡萄糖Glucose |
＋ |
|
氧化酶 Oxydase |
＋ |
乳糖 Lactose |
－ |
注：“＋”表示阳性反应；“－”表示阴性反应。
Note：“＋”means
positive reaction；“－”means
negative reaction.
2.3 药敏试验结果
敏感和中度敏感的抗菌药物见表2。而复方新诺明、妥布霉素、氯霉素、头胞呋肟、苯唑青霉素、庆大霉素、万古霉素、利福平、四环素、呋喃妥因、林可霉素、氨苄青霉素、头胞拉定、链霉素、青霉素、先锋V等抗菌药的抑菌圈在10
mm以下，说明对这些抗菌药均有耐药性。
表2 敏感和中度敏感的抗菌药物
Table
2 Antibacterials of sensitivity and
moderate sensitivity
|
抗菌药 Antibacterials |
抑菌圈直径/mm Diameters of the inhibition zone |
敏感程度 Sensitive degree |
抗菌药 Antibacterials |
抑菌环直径/mm Diameters of the inhibition zone |
敏感程度 Sensitive degree |
|
阿米卡星 Amikacin |
19 |
敏感 Sensitive |
先锋必 Cefoperazone sodium |
22 |
敏感Sensifive |
|
氟哌酸 Norfloxacin |
24 |
敏感 Sensitive |
环丙沙星 Ciprofloxacin |
16 |
中度敏感 Moderate sensifive |
|
菌必治 Ceftriaxone |
18 |
敏感 Sensitive |
先锋噻肟 Cefotaxime |
15 |
中度敏感 Moderate sensifive |
|
复达欣 Fortum |
20 |
敏感 Sensitive |
氧哌嗪青霉素 Piperacillin |
13 |
中度敏感 Moderate sensifive |
|
氧氟沙星 Ofloxacin |
24 |
敏感 Sensitive |
红霉素 Erythromycin |
14 |
中度敏感 Moderate sensifive |
2.4 对动物的致病性
小鼠腹腔注射、皮下注射24
h后均死亡，从感染死亡小鼠体内又分离到感染菌。
3 讨论
经对本菌生物学特性，生理生化试验等一系列研究，确定本菌为铜绿假单胞菌。本菌广泛存在于土壤和污染的水、空气中，本病的发生主要与环境卫生差及管理不当有密切关系。因此，应做好环境的消毒卫生工作，加强饲养管理，预防本病的发生。本试验从病牛脓肿中只分离到一株绿脓杆菌，未分离到其他细菌。
对分离菌24
h普通肉汤培养物，用0.22 μm滤膜过滤，在4
℃以12 000 r/min离心30
min，都未能将分离菌与溶血素分离，说明该菌形态微小，与资料介绍相似[5]。该菌在国内有7个血清型[6]，本试验分离菌株属何种血清型有待于进一步鉴定。据资料介绍该菌感染后可产生抗体[7]，其免疫防治工作有待进一步研究。
该菌对多种抗生素产生耐药性，主要是产生β内酰胺酶，可使细胞的外膜通透性降低及菌体蛋白结构与功能的变化[8]，使抗生素进入菌体内的难易程度发生变化，因此，本病的治疗应根据药敏试验结果，选用高敏药物进行治疗，并且选择几种药物交替使用，防止耐药株的产生。
参考文献（略）