H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析

(1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830001；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150001；3.新疆自治区兽医防疫监督总站，新疆乌鲁木齐 830000)

摘　要：利用RTPCR技术对3株H5N1亚型高致病性禽流感病毒新疆株的NA基因进行了扩增，分别得到了3个毒株的NA基因，序列分析表明，3个毒株NA的全长核苷酸序列均为1 380 bp。同源性分析表明，3个分离株之间的核苷酸同源性在95.1%～97.9%之间；与来自青海、浙江、广东、东南亚等不同地区水禽禽流感病毒毒株的同源性为90.3%～98.8%；与分离自香港、浙江、越南等地区的流感病毒同源性为86.7%～97.9%。

禽流感(Avian influenza， AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类传染性疾病综合征^[12]。其中，高致病性禽流感因其传播速度快、发病率和病死率极高被世界动物卫生组织(Office international des pizooties，OIE)列为必须报告的传染病，我国将其列为一类疫病。到目前为止，我国包括新疆在内的多个省区发生了高致病性禽流感疫情，给我国养禽业造成了巨大的经济损失^[3]。

禽流感病毒基因组由8个(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)分节段的RNA组成，编码10个与病毒结构和功能有关的蛋白。由于禽流感病毒基因的多节段性，使其容易发生变异和重组^[1]。神经氨酸酶(Neuraminidase， NA)由基因组节段6所编码，是一种唾液酸酶，可以在病毒感染靶细胞时，识别细胞表面病毒受体末端的唾液酸残基，促进病毒能够进入细胞^[4]。NA的另一个功能是为要出芽的病毒粒子清理通道，有利于病毒粒子的成熟和释放^[56]。因此，NA与病毒的宿主特异性有关，对流感病毒的复制具有重要的作用。此外，NA是禽流感病毒囊膜纤突的重要组成部分，是病毒表面一种重要的蛋白抗原，诱导机体产生的特异性抗体在一定程度上可以抑制病毒的复制^[78]。因此，对禽流感病毒NA基因的研究成为对AIV研究的热点之一。为了进一步研究禽流感病毒NA基因的功能，掌握新疆禽流感病毒分子流行病学态势，对新疆分离的3株禽流感病毒的NA基因进行了克隆及序列测定分析。

本试验毒株为A/Gs/XJ/10(H5N1)、A/Duck/XJ/4(H5N1)、A/CH/XJ/5(H5N1)，均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离和鉴定。

大肠埃希菌DH5α由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；pMD18T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

TRIzol LS Reagent、MMLV反转录酶购自Invitrogen公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；Taq EX聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司。

参照国内外已发表的H5N1禽流感病毒的NA基因全序列，利用Oligo6.0设计了一对引物，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列如下：

PCR扩增引物序列：上游引物：5′ AGCAAAAGCAGGAGTTCA3′，下游引物：5′ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGA3′。

按照TRIzol LS Reagent试剂盒的使用说明，从鸡胚尿囊液中提取病毒RNA。

以反转录通用引物Uni12为引物，用MMLV反转录酶按照试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s,50.5 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s，循环35次；72 ℃ 10 min。反应结束后，扩增产物置4 ℃保存。

按照DNA胶回收试剂盒使用方法对PCR产物进行纯化，将纯化的PCR产物与pMD18T载体连接，转化DH5α感受态细胞，筛选和提取重组质粒，用10 g/L琼脂凝胶电泳鉴定重组质粒。

将经过PCR鉴定的阳性质粒，送宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。利用DNA Star分子生物学软件，将测序结果与GenBank中收录的国内外不同地区和不同动物源性的参考毒株进行比较和分析。

3株禽流感病毒新疆分离株A/Gs/XJ/10(H5N1)、A/Duck/XJ/4(H5N1)、A/CH/XJ/5(H5N1)的RTPCR扩增产物经电泳鉴定显示，扩增片段大小约为1 380 bp，与预期的目的条带大小相符(图1)。

将获得的阳性质粒进行PCR扩增，得到了约1 380 bp的特异条带，与预期的目的条带大小相符(图2)，说明NA基因cDNA序列均插入到pMD18T中。

M.DNA Marker DL 2 000； 1. A/Duck/XJ/4(H5N1)；2. A/CH/XJ/5(H5N1)；3.A/Gs/XJ/10(H5N1)　

M.DNA标准 DL 2 000；1.阴性对照；2.A/Duck/XJ/4(H5N1)； 3.A/CH/XJ/5(H5N1)；4. A/Gs/XJ/10(H5N1)

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2.A/Duck/XJ/4(H5N1)；3.A/CH/XJ/5(H5N1)；4. A/Gs/XJ/10(H5N1)

2.3.1　用DNA Star分析软件对不同禽源的禽流感病毒新疆株NA基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了同源性比较，结果显示禽流感病毒新疆株之间的同源性在95.1%～97.9%之间。3个毒株的核苷酸序列和氨基酸序列均有不同程度的点突变，但以A/Gs/XJ/10(H5N1)株NA基因的点突变居多。A/Gs/XJ/10(H5N1)株NA基因的核苷酸序列中有51个位点的核苷酸出现了突变。氨基酸序列分析表明，与A/Duck/XJ/4(H5N1)和A/CH/XJ/5(H5N1)株相比，A/Gs/XJ/10(H5N1)株的序列中氨基酸的变化数量居多。结果见图3、图4和表1。

　　　　　　　　　　　　　　1.A/CH/XJ/5/seq；2.A/Duck/XJ/4/SEQ；3.A/Gs/XJ/10/seq

Table 1　Homology analysis in nucleotide sequences of NA genes of Xinjiang strains

编号 Number	1	2	3
1		97.9	95.3
2	2.1		95.1
3	4.9	4.8

2.3.2　用DNA Star分析软件对禽流感病毒新疆株NA基因核苷酸序列与国内外不同毒株进行同源性比较，结果显示，3个禽流感病毒新疆株NA基因与来自不同地区禽源禽流感H5N1毒株的NA核苷酸序列同源性为86.1%～99.2%；与不同动物来源毒株的核苷酸序列的同源性比较，与来自福建猪毒株(A/Swine/Fujian/F1/2001)的同源性为94.9%～ 97.6%；与来自泰国虎毒株(A/Tiger/Thailand/SPB1)的同源性为94.5%～97.5%；与来自人源毒株的核苷酸序列同源性比较，与1997年香港株(A/HongKong/156/97(Human))的同源性为86.7%～87.2%，与2006年浙江人的分离毒株(A/Human/Zhejiang/16/2006(Human))的同源性为95.1%～97.6%，与越南人的分离株(A/Vietnam/CL01/2004)的同源性为94.7%～97.9%；与来自香港、日本、广东、广西等不同地区的水禽如天鹅、白鹭、鹅、鸭等分离株的同源性为92.7%～99.2%，与2005年青海野禽分离株(A/BarheadedGoose/Qinghai/62/05)的同源性为95.3%～98.6%。结果见表2。

2.3.3　用DNA Star分析软件对禽流感病毒新疆株NA基因的核苷酸序列与GenBank收录的参考毒株进行了分子系统进化分析，结果见图5。

表2　H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因与参考株NA基因核苷酸序列的同源性比较

Table 2　Homology comparison in nucleotide sequences of NA genes of Xinjiang strains with other AI strains

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26
	99.7	92.0	94.3	99.9	98.4	95.8	93.3	98.8	98.1	98.9	98.9	92.2	90.7	98.7	92.2	97.4	86.9	87.3	87.3	97.2	99.2	98.8	95.9	98.8	98.0