猪卵母细胞超低温冷冻保存技术研究进展＊
朱良成1，芮 荣1*，张德福2
（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京
210095；2.上海市农业科学院畜牧研究所，上海
201106）
摘 要：猪卵母细胞有其特殊的生理构造，其冷冻效率一直很低，有关猪卵母细胞冷冻保存的研究尚处在探索阶段。猪卵母细胞冷冻保存方法，主要有快速冷冻和玻璃化冷冻两种，后者的冷冻效果似乎要优于前者，暗示着玻璃化冷冻在猪上的应用可能比程序化法更为优越。在玻璃化冷冻方面，包括OPS法、微滴法和电镜铜网法等，都是在冷冻载体上加以改进。此外，在冷冻保护剂、冷冻程序等方面，仍需要改进和优化，以期进一步提高猪卵母细胞的冷冻效率。
关键词：卵母细胞；冷冻保存；猪
动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，卵母细胞的长期冷冻保存，在动物繁育、遗传资源保护、资源共享与交换、挽救濒危动物和动物克隆生产等方面都具有独特的优势和应用价值。自Whittingham D G[1]首次成功的冷冻成熟的小鼠卵母细胞以来，卵母细胞冷冻保存研究已涉及的哺乳动物包括小鼠、兔、山羊、牛、马和人类等。Chen C[2]首次报道了冷冻人类成熟卵母细胞取得成功，并获得双胎妊娠。迄今为止，冷冻解冻卵母细胞已在小鼠、兔、牛等动物及人类获得成活的后代。但猪卵母细胞由于其胞质内含有大量的脂滴，对低温较为敏感，冷冻保存更为困难。目前，猪胚胎（尤其是桑椹胚、囊胚）冷冻保存研究虽然已取得一些进展，经解冻和胚胎移植后已有多例成活后代产生，但猪卵母细胞冷冻保存一直进展缓慢，大多数报道仍限于猪卵母细胞冷冻方法学研究，冷冻效率仍然偏低，研究和改进冷冻方法仍是一项重要的任务。
1 猪卵母细胞冷冻保存技术
猪卵母细胞的冷冻保存难度较其他动物要大，相关研究报道较少。Kashiwasaki N等[3]首次取得了冷冻成功的猪胚胎，但时至今日获得冷冻猪胚产仔的数量依然很少，猪卵母细胞冷冻保存至今仍未获得后代。
1.1 卵母细胞的冷冻保存方法
（1）快速冷冻。卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理后，以1 ℃/min速度降温，在-5 ℃～-7 ℃诱发结晶，然后以0.3 ℃/min～0.8 ℃/min的速度降温至-30 ℃～-40 ℃，投入液氮中保存。该法是程序化冷冻的基础程序。
（2）玻璃化冷冻。玻璃化冷冻是把卵母细胞置于高浓度冷冻保护液中，经过短时间平衡（1 min～2 min）或不平衡，直接投入液氮保存。玻璃化是指利用物理原理将高浓度保护剂降温后由液态转化为类似玻璃态的稳定而透明的非晶体化固体物质状态。该固体物质可保持液态时正常分子与离子分布，卵母细胞在这种冷冻液中脱水至一定程度后，内源性胞质大分子（如蛋白质、脂类）及已渗透入胞内的冷冻保护剂浓缩，在冷冻过程中形成胞内玻璃化而不形成冰晶，因而避免了细胞内形成冰晶造成的化学和物理损伤，使卵母细胞得到保护。它是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，一般是将经过不同防冻剂浓度平衡的卵母细胞由0 ℃以上温度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷冻多采用两步法，即先用低浓度的冷冻保护剂预平衡3 min～5 min，再放入终浓度冷冻液，立即装管，经液氮熏蒸1 min～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。该法的特点是细胞在室温脱水后不需要降温程序，简便易行，该过程中水分在细胞内外都要结晶。该法主要在小鼠、牛等动物报道较多。
1.2 冷冻保护剂的选择
程序化冷冻猪的卵母细胞效率并不高，很多学者在冷冻剂的种类和浓度上做了大量的研究，试图找出一种适合于猪胚胎或卵母细胞冷冻的最佳程序。Huang W T等[4]以细胞毒性实验来研究甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、1,2-丙二醇（PROH）4种常用的冷冻保护剂对猪卵母细胞的影响。结果显示无论在室温或10 ℃，甘油做冷冻保护剂时GV期的卵母细胞的存活率要低于其他组；在10 ℃，EG做冷冻保护剂时MⅡ期卵母细胞的存活率要高于其他3组（40％对23%～26%，P<0.05）。说明在猪卵母细胞冻存上，各种冷冻保护剂均具有保护猪卵母细胞的作用，但效果不一致，甘油的效果较差，EG相对较好。人、牛和山羊卵母细胞的冷冻试验表明，4种常见的冷冻保护剂效果为EG>PROH>DMSO>甘油[5-7]。Huang W T等的试验结果同其他哺乳动物卵母细胞冷冻的试验结果相近，说明4种常见的冷冻保护剂在猪上没有显示出特殊性，EG作保护剂仍是较好的选择。然而，根据现有的资料发现，许多研究者在冷冻保存猪卵母细胞时，仍选择甘油作冷冻保护剂。因此，究竟哪一种冷冻保护剂在猪上更为有效迄今尚未定论，其最佳使用浓度亦需进一步探讨。
目前，在动物卵母细胞冷冻方面，玻璃化冷冻法颇受青睐，发展十分迅速。从现有的资料来看，玻璃化冷冻在小鼠、绵羊和牛等动物上有逐步取代程序化冷冻之势。在猪上，究竟用哪种冷冻方法较好还处于探索之中。总的来看，玻璃化法的冷冻效果似乎要好于程序化法，暗示着玻璃化冷冻在猪上的应用可能比程序化法更为优越。
2 方法学研究
猪卵母细胞中存在大量的脂肪颗粒，对温度很敏感，与其他哺乳动物卵母细胞相比，对低温的耐受性较差，这给猪卵母细胞的冷冻保存带来了很大困难。许多研究表明，无论是程序化法还是玻璃化法保存猪卵母细胞，其冷冻效率均很低，这同保存猪遗传资源的实际需要尚有距离。Francoise B等[8]认为，猪胚胎的冷冻方法主要有3种，即快速冷冻，常规玻璃化冷冻和开放的拉长细管法(open pulled straw,OPS)冷冻。虽然如此，近几年来在猪上仍不断有新的冷冻方法发展出来，其中很多方法都具有较大改进与创新。
2.1 玻璃化法
如前所述，猪早期胚胎冷冻沿用了其他哺乳动物胚胎冷冻方法，使用高浓度（通常6.0 mol/L～8.0 mol/L）的冷冻保护剂作冷冻液，在装入细管后直接或在液氮蒸汽中平衡数分钟后投入液氮。但这种常规的玻璃化法操作，在猪上的冷冻效率很低，冻后成活率一般为10%～30%。
2.2 OPS法
Vajta G等[9]使用一种新的冷冻方法——OPS法并获得成功，大大提高了猪冷冻胚胎的存活率。他将普通0.25 mL细管加热，拉制成约为原来1/2的内径，将胚胎放入1 μL～2 μL的冷冻液后利用虹吸法将胚胎吸入拉制后的OPS管。由于OPS管内径更细，减少了胚胎周围的冷冻液量，从而使冷冻速率大大提高。普通细管的冷冻速率通常为2 500 ℃/min左右，但OPS管的冷冻速率可达20 000 ℃/min,使胚胎在冷冻过程中可迅速通过致死温区而不至于受到损害。Vajta使用该法冷冻，获得了91%(48/53)的胚胎存活率。Holm P等[10]用此法也获得了较高的囊胚发育率（71%）。Francoise B等[11]利用OPS法冷冻猪胚胎，移植后获得冻胚仔猪。此外，Cuello C等[12]用超细OPS(superfine,OPS)法和Vit Master SOPS法研究新鲜猪囊胚冷冻保存，两种方法的降温速度均超过了20 000 ℃/min，分别获得57.4％～95.5％和67.6％～93.3％的胚胎存活率。降温速度超过20 000 ℃/min之后，对胚胎存活率已无大的影响。这些研究表明，OPS法能大大提高冷冻胚胎的存活率，是一种较为实用的冷冻方法。
2.3 微滴法
微滴法（microdroplet）是使用微量冷冻液进行冷冻的一种方法。将含有卵母细胞或胚胎的冷冻小滴（约6 μL）直接滴入到液氮中，让包含有卵母细胞或胚胎的冷冻小滴冷冻成固态，然后收集这些固态颗粒于小管中，置于液氮中保存。另一种做法是，先在1 mL冷冻管中做成含胚胎或卵母细胞微滴，然后将冷冻管直接投入液氮中保存。微滴法操作简单，最早用于小鼠的胚胎冷冻保存，在猪上的应用也取得突破。Misumi K等[13]用微滴法保存猪胚胎，解冻并培养24 h后，胚胎存活率为91.3%（21/23），显著高于细管法的70.0%（14/20），经胚胎移植后获得27头仔猪。Kouji M等[14]报道，在不进行任何前处理的情况下，使用微滴法和细管法冷冻猪早期胚胎，解冻后微滴法的胚胎存活率和囊胚孵化率均显著高于细管法，移植冻胚产下17头仔猪。表明微滴法也能用于猪胚胎的冷冻保存，并取得较好的效果。
2.4 电镜铜网法
电镜铜网法（electron microscopic grids）是新近出现的一种玻璃化冷冻方法。它利用电镜铜网作为胚胎或卵母细胞载体，使胚胎或卵母细胞处于小体积（1 μL）冷冻液中，直接投入液氮保存，其冷冻速率可达3 000 ℃/min以上。Martino A等[15]用电镜铜网法冻存牛卵母细胞，解冻后形态正常率为60%，体外受精后卵裂率和囊胚发育率分别达到29%和10%。目前，尚未见用电镜铜网法冷冻猪胚胎或卵母细胞的报道，该法是否适用于猪胚胎或卵母细胞的冷冻保存，有待进行相关的研究说明。
2.5 固体表面法和冷冻环法
Begin I等[16]用固体表面法（solidsurface vitrification，SSV）和冷冻环法（cryoloop vitrification，CLV）进行山羊卵母细胞的超低温冷冻，比较不同载体对冷冻效果的影响。其中SSV法是将含有卵母细胞的冷冻液滴到浸入液氮的金属表面，其卵母细胞冻后存活率为60%；而CLV法是将含卵母细胞的冷冻液滴于冷冻环薄膜上，然后浸入液氮，结果取得了89%的存活率。
2.6 其他方法
在猪上，除了在冷冻载体上进行技术改进之外，添加保护因子和对卵母细胞或胚胎进行细胞处理也能改善猪胚胎或卵母细胞的冻存效果。在外加因子方面，Men H等[17]在研究体外生产猪囊胚超低温冷冻时发现，向体外发育培养基中加入胎牛血清，能显著提高冷冻解冻后的胚胎存活率。在细胞处理方面，猪胚胎或卵母细胞内含有大量的脂肪颗粒，被认为是对低温敏感的主要原因。因此，有学者在冻存猪胚胎或卵母细胞之前，显微去除其内脂肪颗粒或先进行离心后再冻存，结果大大提高了胚胎或卵母细胞的存活率，证明去脂处理是提高冻后存活率的手段之一[18]。此外，Dobrinsky J R等[19]证明了细胞松弛素能改善胚胎或卵母细胞内部结构，在冷冻液中加入细胞松弛素B，能提高猪胚胎或卵母细胞的冷冻效率。
3 影响猪卵母细胞低温冷冻的因素
3.1 常见因素
同其他哺乳动物一样，猪卵母细胞或胚胎在冷冻解冻的过程中受很多因素的影响，造成了其卵母细胞或胚胎冷冻效率低，克服这些常见因素的影响是低温生物学的一项重要课题。常见的卵母细胞、胚胎冷冻受损因素可归纳如下：①细胞内冰晶形成，细胞结构破坏;②细胞外冰晶形成引起物理损伤;③冷冻保护剂的毒性;④胞膜内外渗透压差引起细胞萎缩或膨胀;⑤冷冻对细胞的损伤;⑥细胞质量等。这些因素在冷冻解冻过程中都客观存在，如何减小或克服这些因素对细胞的影响，一直是猪胚胎或卵母细胞冷冻研究的重要任务之一。
3.2 特殊因素
众所周知，猪卵母细胞或胚胎细胞质中含有大量的脂肪颗粒，这与其他哺乳动物有显著区别。多数学者认为，猪卵母细胞或胚胎内存在的大量颗粒会使它本身对温度更敏感，更易于受到损伤，是猪卵母细胞或胚胎较难冻存的重要原因。
Nagashima H等[20]认为，猪胚胎内含有的脂肪颗粒是造成猪胚胎冷冻细胞膜损伤的部分原因。他们在其后的试验中对猪胚胎进行离心，除去脂肪颗粒，再进行冷冻，结果解冻后胚胎存活率要大大高于未除去脂肪颗粒的胚胎。Dorbrinsky J R等[21]证明，猪胚胎内含有很多的脂肪颗粒导致它对温度更敏感。由此可见，很多学者曾设想将猪卵母细胞或胚胎离心并除去其中的脂肪颗粒，再进行冷冻，以观察冷冻的效果。Nagashima H等 [22]在研究冷冻时，用猪体内成熟的卵母细胞在除去脂肪颗粒，并卵周隙显微受精之后进行冷冻，结果其发育越过了8-细胞期。2-细胞～4-细胞期的猪胚胎在经过去脂肪颗粒、冷冻后，也被证明具有发育潜力，并获得了后代。以上结果说明，卵母细胞内大量的脂肪颗粒可能是阻碍猪卵母细胞冷冻成功的重要原因之一，去除胞内的脂肪颗粒，有助于提高猪卵母细胞冷冻存活率。
Dobrinsky J R等[23]研究了冷冻对猪胚胎显微结构的影响。他们在显微镜下观察到超低温冷冻扰乱了胚胎细胞膜和微丝的有序结构，使这些微丝系统重构，形成新的骨架系统支撑整个细胞。解冻时，这些微丝系统又会恢复到正常状态。因此，Dobrinsky J R等认为稳定细胞骨架有助于提高猪胚胎的冷冻效率。在以后的试验中，他们在冷冻液中添加细胞松弛素B，结果比对照组的冷冻效果要好。这说明保护卵母细胞或胚胎的细胞膜和微丝系统有助于提高两者的超低温冷冻的效果。
4 应用前景
目前，在世界范围内某些珍贵的地方猪种已经或濒临消失。如何保存猪种资源，是科学工作者面临的一项新课题。猪卵母细胞的冷冻保存可为解决这一问题提供有效的途径，具有较高的可行性和可操作性，该技术的发展为猪遗传资源的保护带来了乐观的前景。在有些发达国家，已经建立起多种哺乳动物的胚胎库，每个品种的动物均冻存有一定数量的胚胎或卵母细胞，为动物品种资源的保护提供了保障,很值得我国在动物品种资源的保存上加以借鉴。另一方面，猪胚胎冷冻保存虽获得后代，但仍停留在实验阶段，离实际应用尚有距离，主要原因是猪胚胎或卵母细胞冷冻存活率和发育潜力低下。因此，如何提高猪胚胎或卵母细胞的冷冻效率仍是一个重要的研究方向。OPS法等冷冻技术的出现，为猪卵母细胞的冷冻保存提供了技术平台，但有必要进一步提高冻后存活率。
就目前的研究资料和实践经验来看，玻璃化冷冻比程序化冷冻在猪上更具可操作性和前瞻性；而减少卵母细胞与冷源（如液氮等）的空间距离，提高冷冻降温速度，可能是提高猪卵母细胞冷冻效率的最为有效的方法。其他技术如离心、去脂肪颗粒等也能在一定程度上提高冷冻效率，但操作繁杂，有待优化。总的说来，为使猪卵母细胞冷冻保存实用化，开发新技术、进一步提高冷冻效率是十分必要的。
参考文献（略）
＊收稿日期：2005-12-09
基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字2003第14-1号）
作者简介：朱良成（1978-），男，湖北孝感人，硕士，主要从事动物生殖生物学与生殖疾病控制研究。*通讯作者