小鼠胚胎HtrA1丝氨酸蛋白酶表达研究进展*

贾 坤，曹 雷，师志海，李守军^*

（华南农业大学兽医学院，广东广州 510642） 

摘 要:HtrA1丝氨酸蛋白酶是哺乳动物HtrA丝氨酸蛋白家族的成员之一，是一种分泌蛋白，与细胞外基质的降解作用有关，有研究证明其在抑制癌症的发生发展过程中有着重要的作用。HtrA1丝氨酸蛋白酶在小鼠胚胎的多种组织中都有表达，并且在胚胎的组织和器官形成过程中具有重要的作用。近年来，对其表达的研究也越来越多，文章对HtrA1丝氨酸蛋白酶在小鼠胚胎发育中的表达进行了综述。

关键词:HtrA１；丝氨酸蛋白酶；转化生长因子β；胚胎

HtrA1(high temperature requirement A1,HtrA1)丝氨酸蛋白酶最初是在肉瘤病毒40（SV 40）成纤维细胞中检测到的^[1]，之后在软骨关节炎病例中也检测到^[2]。在骨性关节炎中起正调节作用，对成纤维细胞的转化、卵巢癌、黑色素瘤的向下调节作用也是引人注目的。在哺乳动物中，小鼠的HtrA1丝氨酸蛋白酶可以抑制转换生长因子β（TGFβ）蛋白家族介导的信号传导，并在起调节作用的特定区域表达，HtrA1对TGFβ蛋白的结合和抑制作用是根据完整的HtrA1丝氨酸蛋白酶功能区来完成的。研究证明TGFβ家族是这一蛋白作用的靶点^[3]。事实上，作为生长因子的TGFβ家族在调节细胞分化和组织形态形成方面起重要作用，像细胞分裂一样，通过胚胎不同发育阶段的第一诱导和第二诱导来调节信号^[4]。有人用蛋白印迹法、RT-PCR和IHC染色分析法曾检测到HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达及胚胎发育过程中相应的mRNA，表明HtrA1丝氨酸蛋白酶在小鼠胚胎中有广泛的表达区域。此外，这种表达是短暂的，整个胚胎RNA印记法显示在器官生成的早期(E8)检测到相对低水平的HtrA1 丝氨酸蛋白酶mRNA，在器官生成的后期(胚胎发育的第14天至第19天)这种表达又会加强。HtrA1丝氨酸蛋白酶在胚胎早期几乎不起作用，在器官生成时才起作用。特别是HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达随妊娠母体年龄的增加在胚胎某些器官如肺脏、心脏、上皮组织中增强，而在神经系统中却是递减的。

1 结构及功能性区域

HtrA丝氨酸蛋白酶家族具有高度保守的胰岛素丝氨酸蛋白酶(SP)区域和1个～2个C末端的PDZ区域。PDZ区域是像复杂信号系统那样起中央调节作用的蛋白与蛋白模型。那些N末端区域内，每个HtrA丝氨酸蛋白酶很可能在此区域有生理调节的功能，例如，把蛋白质限制在特定的细胞间隙。

HtrA1丝氨酸蛋白酶包含有分泌作用的信号序列，它有两个孤立的同源性区域，其中N末端是以胰岛素生长因子结合蛋白^［5］和卵泡抑素^［6］为特征的基因产物，第二领域40%以上与细菌HtrA丝氨酸蛋白酶相似，此外，在IGF结合物领域的末尾和蛋白酶领域的开始，与蛋白酶抑制因子的类型相似。虽然HtrA1和HtrA2在C末端区域里分享相应的SP领域和PDZ领域，但是HtrA1包含分泌的一个信号序列，以及像胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)领域和在N末端区域一种Kazal类型丝氨酸蛋白酶抑制剂(KI)。HtrA2的连接区域主要是三聚物的形式，由此推测HtrA1也有可能形成同型三聚体。每一种HtrA1突变体与TGFβ家族蛋白的结合，能够密切生成三聚物结构。但是 FS/linker（交联子突变体），缺乏必要的连接部位，所以不能与TGFβ家族蛋白结合。

2 与HtrA1丝氨酸蛋白酶表达有关的TGFβ 家族

小鼠的HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达模式在TGFβ家族蛋白调节位点上有着惊人的关联性。TGFβ家族是由30种以上的蛋白质组成的，其中包括TGFβs, BMPs,生长/分化因子(Gdfs)和苯丙酸诺龙。这些蛋白质在胚胎生成及成年组织中表现出不同的空间时间模式，在组织发展中起着调节稳定的作用。尽管TGFβ发出的信号能在不同阶段调控，但是它们广泛地通过受体激活作用在细胞外调节，已经证明存在于细胞外间隙的一群对抗物属于BMP亚科蛋白，因此阻碍受体的激活作用，然而已知的只有少数的蛋白是TGFβ亚科的对抗物。令人惊讶的是，HtrA1对TGFβ蛋白的结合和抑制作用是根据完整的HtrA1丝氨酸蛋白酶功能区来完成的。

3 HtrA1丝氨酸蛋白酶表达位点的检测方法

为了精确定位HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达位点，以便更进一步了解其生物学功能，目前国内外采用的试验方法主要有Northern印迹杂交，RT-PCR法，免疫组织化学法和原位杂交法等。应用这些方法，可以从不同的水平对HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达进行检测，从而使检测结果会更全面。

4 胚胎组织和器官中HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达

在胚胎的组织生成过程中，HtrA1丝氨酸蛋白酶密切联系其全过程。如果把整个孕期分为3个阶段，在胚胎发育的第一阶段，HtrA1丝氨酸蛋白酶只显示出低水平的表达，但是在第二和第三阶段，则会显示出强烈的表达水平。在胚胎的脑、心脏、生殖腺、软骨等器官和组织中，都有HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达。4.1 HtrA1丝氨酸蛋白酶在胚胎脑组织中的表达

脑组织中HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达，可以在起源于神经上皮的脉络丛中观察到。最近在有选择地敲除小鼠骨形成蛋白（BMP）受体基因的研究中，证实了BMP信号在脉络丛发育过程中的重要性。在端脑中形态形成蛋白（BMPr1a）基因的破坏，也会导致脉络丛结构的缺陷^［8］。

4.2 HtrA1丝氨酸蛋白酶在胚胎心脏和生殖腺中的表达

在心脏和生殖腺的的发育过程中，HtrA1丝氨酸蛋白酶的表达密切联系EMT（epithelial mesenchymal transition）和TGFβ信号的调节过程。在胚胎的心脏，HtrA1丝氨酸蛋白酶在心室的心内膜瓣和动脉瓣表达。在胚胎发育前期，HtrA1丝氨酸蛋白酶在心内膜瓣表达。在胚胎发育后期，HtrA1丝氨酸蛋白酶在动脉瓣强烈表达。房室瓣和动脉瓣的发育取决于TGFβ蛋白发出的信号。TGFβ2诱导这些部位组织上皮与间质上皮的转换，并赋予它们间质的特性^［9］。同样，TGFβ2在小鼠的心中隔及瓣膜由于EMT的干扰而表现缺乏^［10］，TGFβ家族成员之一的抗中肾旁管激素（AMH），可以诱导细胞凋亡和EMT^［11］。HtrA1丝氨酸蛋白酶还在雄性或雌性生殖腺的缪勒管细胞和间质细胞中表达。HtrA1丝氨酸蛋白酶mRNA在间质细胞比在肺上皮细胞更容易检测到。TGFβ家族成员的介导在间质上皮细胞的发育及呼吸道分化过程中也起重要作用^［12］。在对恶性癌症有差别的基因表达的研究中也提出HtrA1丝氨酸蛋白酶与EMT的关系，HtrA1丝氨酸蛋白酶在黑素瘤和卵巢癌后期的进展或转移中的抑制作用也已被证实^［13］。因此，HtrA1丝氨酸蛋白酶可以通过对抗TGFβ信号来抑制癌细胞的发展。

4.3 HtrA1丝氨酸蛋白酶在胚胎骨组织中的表达

骨组织是形态形成过程中TGFβ信号最集中的部位。在胚胎的骨及其周围组织的发育过程中，HtrA1丝氨酸蛋白酶有可能抑制软骨细胞的分化并能将间质转化为非软骨型，例如骨膜、软骨膜、关节、肌腱和韧带。这与BMPs 和TGFβs能增强间质细胞转化为软骨细胞的事实相吻合^［14］。在软骨骨化过程中，发育成熟的软骨细胞开始增生，退化并被钙化的骨取代。在骨化作用开始之前，HtrA1丝氨酸蛋白酶在间质细胞或软骨浓集区域是不表达的，当骨浓集部位骨化作用开始之后，HtrA1丝氨酸蛋白酶在靠近骨化中心的肥大软骨细胞上开始表达，在成年动物的关节软骨或骺生长板上的肥大软骨细胞也会表达。当人工注射抗胶原抗体或脂多糖时会诱导软骨细胞发生肥大分化，并且开始表达HtrA1，表明在正常或是人工病理条件下，肥大细胞都会诱导HtrA1的表达。曾有报道称HtrA1会抑制TGFβ发出的信号，研究发现HtrA1消化液主要成分与软骨成分相似，例如聚集蛋白聚糖、核心蛋白多糖、纤维调节素，还有可溶性的Ⅱ型胶原。在成熟骨组织，HtrA1丝氨酸蛋白酶是贮存在骨基质中的, 这里是TGFβ1高浓集区^［15］。在HtrA1的表达模式和不同的TGFβ蛋白之间有着惊人的联系，包括其在卵泡抑素中的存在领域，说明HtrA1在TGFβ介导中有重要作用。肌腱细胞持续产生HtrA1蛋白，在关节软骨或软骨细胞生长板上检测不到有意义的HtrA1丝氨酸蛋白酶。然而，当用抗胶原抗体诱导小鼠实验性关节炎时，关节软骨细胞尤其是深层细胞，开始产生高水平的HtrA1 丝氨酸蛋白酶。虽然HtrA1 丝氨酸蛋白酶在前软骨和软骨细胞不能表达,但在骨化中心却强烈表达。肌腱和韧带的发育也是依赖BMP/Gdf蛋白发出的信号来调节。BMP信号最先出现在肌腱形成的特定区域，然而附加的信号，例如Gdf6, Gdf7 和TGFβ2,则需要肌腱的进一步成熟，因为HtrA1丝氨酸蛋白酶在肌腱发育后期中表达，或许HtrA1丝氨酸蛋白酶能调节肌腱的成熟。

5 结语

目前已经知道HtrA1丝氨酸蛋白酶广泛地结合于TGFβ蛋白家族，包括BMP,Gdf 和TGFβ。在结构上, HtrA1丝氨酸蛋白酶具有用于分泌作用的信号序列,并具有两个独立的同源区域，在PDZ域后还有高的保守区域。HtrA1丝氨酸蛋白酶在小鼠胚胎的不同组织都有表达，在细胞形成及分化过程中起到重要的分泌调节作用，并且参与TGFβ蛋白信号的生理调节。但是当前对HtrA1丝氨酸蛋白酶的研究尚处于初期阶段，仍需加强对HtrA1丝氨酸蛋白酶的研究，以期进一步了解其更多的生物学功能，为更广泛的应用于临床实践提供理论基础。

参考文献（略）