一种轮状病毒特异抗体ELISA检测方法

（中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所，云南昆明　650118）　

摘　要：　在实验室条件下，建立较为快速的轮状病毒抗体ELISA检测方法。利用组织培养的轮状病毒SA11株经初步的浓缩和纯化后，作为包被抗原包被酶标板。SDS-PAGE分析表明，经浓缩纯化后，轮状病毒的主要抗原均存在。将测试血清用SA11中和后，轮状病毒或其抗原免疫血清（肠黏液，粪便悬液）的OD₄₉₀值比中和前有明显的下降，下降比率大于45%，而对照组血清的OD₄₉₀值与中和前相比没有明显的变化，下降比率小于9%。表明用此ELISA体系检测轮状病毒抗体具有特异性。

关键词：　轮状病毒；酶联免疫吸附试验；中和实验；抗血清

轮状病毒的检测方法，在临床上主要有ELISA、EM、SDS-PAGE等几种方法，主要是检测轮状病毒抗原。由于ELISA检测法具有快速、简便的特点，仍是目前检测轮状病毒感染的首选方法。对于轮状病毒抗体的检测，目前国内没有商品化的试剂盒出售。一个较精确的轮状病毒抗体检测体系，对于轮状病毒的免疫反应研究、轮状病毒疫苗的免疫效果评价等工作而言，都是必不可少的。

家禽、家畜的幼仔中普遍存在轮状病毒的感染。实验发现，豚鼠、小鼠在从洁净环境向一般饲养条件转移时可获得性感染轮状病毒，对轮状病毒相关的研究带来了不便。此研究建立了一种可靠、简单、经济的ELISA检测方法，可用于检测经免疫后的实验动物、家禽或家畜体内轮状病毒的特异抗体，也可用于免疫前筛查。

96孔酶标板为Titertek公司出品，洗板机为Thermo公司产品。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、豚鼠IgG或IgA，PEG 8 000购自Sigma公司。

轮状病毒SA11株，非洲绿猴肾细胞MA104为本室保存。MEM培养基购自GIBCO公司。当细胞长成单层后，接种10 m.o.i（感染复数，Multiplicity of infection）的SA11，用含5 μg/mL胰酶的无血清MEM培养基培养。在48 h～72 h内，出现明显病变时，于37 ℃和-80 ℃反复冻融2次，11 000 g离心15 min，取上清，加入使其终浓度为100 g　L PEG -8 000,NaCl终浓度为23 g/L，室温孵育过夜，于4 000 g离心10 min，将沉淀用离心前体积1-50的碳酸盐包被液重悬，于70W超声30 s后，于4 000 g离心10 min，将上清取出，分装保存于-20 ℃^[1]。

用Bradford法测定病毒浓缩液中的蛋白含量^[2]。标准曲线的幂值为0.9995。测定轮状病毒浓缩液的蛋白含量为7.85 g/L, 用碳酸盐包被液稀释50倍～100倍后，取100 μL/孔包被96孔板。

　取浓缩液10 μL，于100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。经考马斯亮蓝染色后，观察轮状病毒的相关抗原。

用常规的间接法检测轮状病毒抗体^[3]。本试验中使用了大肠杆菌表达轮状病毒SA11株VP4的免疫豚鼠血清，腺病毒表达SA11株VP4的免疫小鼠血清、肠悬液、粪便悬液，杆状病毒表达VP4的豚鼠免疫血清，SA11株VP7的DNA疫苗免疫豚鼠血清，大肠杆菌表达VP7的小鼠血清，SA11株免疫豚鼠血清等作为ELISA的检测对象，以确证经浓缩后的轮状病毒液包被96孔板的效果。以上血清均为本室制备及保存。以相应的阴性动物血清或免疫前血清做对照。

取以上待检血清或肠黏液倍比稀释后，试验组与100 TCID₅₀的SA11于37 ℃中和2 h，对照组加入等体积维持液于37 ℃放置2 h后，于同一块酶标板做ELISA检测。　

轮状病毒浓缩液的SDS-PAGE电泳结果显示，轮状病毒的主要抗原VP1, VP2,VP4,VP6,VP7均存在（图1）。特异性鉴定中，轮状病毒及其抗原的抗免疫血清、轮状病毒及其抗原免疫小鼠的肠道黏液及粪便悬液与SA11中和后，OD490值比对照血清有明显下降，下降比值均大于35％，见表1。表明用此方法检测此类血清是特异的。　

表1　不同测试样品经SA11中和处理后用ELISA检测的OD₄₉₀ 变化结果

Table 1　OD₄₉₀ comparison of different tested samples before and after neutralizing with rotavirus SA11　

注：①“*”表示稀释度的确定根据原始样品的量而定，肠黏液和粪便悬液的稀释度是相对稀释度，而不是原始稀释度。即使用相等体积的PBS冲洗或溶解同等质量的肠道或粪便，在此基础上再进行稀释；②“**”表示下降比率用中和前与中和后的OD值的差值除以中和前的OD值；③“-”表示比率为负值。

Note:①“*” The specimens were diluted according to the original mass or volume. Intestinal elution or fecal specimens were eluted or dissolved with identical volume of PBS, and diluted further；②“**” The decreasing rate was calculated as the ratio of the reduction OD490 value after neutralization to that before neutralization；③“－” indicated that the ratio was negative.　

　　虽然可以使用轮状病毒的组织培养上清液直接包被96孔酶标板，进行轮状病毒抗体的检测，但是由于组织培养液中存在很多影响ELISA结果的成分，而且对于批次实验，包被抗原的含量难于确定，因此给实验带来了很多不确定因素。我们针对轮状病毒SA11株建立的轮状病毒特异抗体的ELISA检测方法操作简便，经特异性鉴定发现，该方法对轮状病毒抗体是特异的。

该方法可用于实验室的相关研究，或对实验动物进行轮状病毒抗体的筛查。我们用此方法检测了实验用Balb／c小鼠的轮状病毒抗体，发现在一般的饲养条件（室温，笼养）下，小鼠的血清轮状病毒抗体随饲养时间延长，有上升的趋势，扣除批次差异，OD₄₉₀均值由初始的0.2上升为0.6至1.5不等。尤其在自来水和双蒸水喂养组有明显差异，和更换水的次数及饲养密度有关。我们同时还检测了实验用恒河猴血清中轮状病毒特异抗体的携带情况。

在检测的40只猴（年龄为5月龄至12月龄）中，在血清抗体滴度为1∶32时，OD₄₉₀　最高为0.623,最低为0.129,且随稀释度升高而下降，在1∶512以后，下降趋势减慢。显示此年龄段恒河猴中轮状病毒血清抗体水平较低。

轮状病毒抗原的检测试剂盒早已为科研和临床广泛应用。用病毒抗原捕获抗体的方法检测轮状病毒抗体，尤其是IgA的方法更为精确。但受经济和实验条件的约束，直接用轮状病毒感染细胞裂解液包被酶标板也十分常见。我们在此基础上加以改进，用轮状病毒浓缩液来包被酶标板，简单经济，比直接使用细胞裂解液的方法，实验数据稳定，易于控制，并且可推广至其它血清型轮状病毒抗体的检测。

(Chinese Academy of Medical Science, Institute of Medical Biology, Kunming,Yunnan,650118,China)　

Abstract:　A rapid ELISA method for Rotavirus antibody detection was established under the common laboratory conditions. Cellcultured Rotavirus SA11 was concentrated and partial purified and then used to coat the 96　well microtiter plates. The virus concentration was analyzed by SDS-PAGE to confirm the existence of most virus antigens. The tested sera, intestinal fluids, and fecal supernatant were neutralized by SA11. After neutralization, the OD₄₉₀ values of the samples collected from rotavirus or its antigens immunized animals decreased significantly(>45% of the original specimens),while the OD₄₉₀values of the control samples did not change obviously ( <9% of the original specimens).The result demonstrated that the ELISA method was specific for rotavirus antibody detection.

收稿日期： 2004-08-25

作者简介：刘　馨(1977-)，女，云南禄丰人，博士，主要从事基因工程疫苗研究。　

测试血清 Tested sera	免疫原Immunogen	稀释度* Dilution titers	中和前OD 490均值Means of OD 490 before neutralization	中和后OD 490均值Means of OD 490 after neutralization	下降比率**Decreasing rate/%
豚鼠抗血清Guinea pig ntiserum	大肠杆菌表达SA11 VP4SA11 VP4 expressed by E.coli	1:4	1.938	1.021	47.3
豚鼠抗血清Guinea pig antiserum	杆状病毒表达SA11 VP4SA11 VP4 expressed by baculovirus	1:16	0.715	0.353	50.6
豚鼠抗血清Guinea pig antiserum	表达SA11 VP7的DNA疫苗pcDNA3 VP7	1:4	1.230	0.674	45.2
豚鼠抗血清Guinea pig antiserum	组织培养SA11Cell culture SA11	1:16	1.430	0.578	59.6
豚鼠阴性血清Guinea pig negative serum	未免疫Nonimmunized	1:4	0.519	0.533	－
小鼠抗血清Mice antiserum	表达SA11 VP4的重组腺病毒Adenovirus expressing SA11 VP4	1:16	0.654	0.333	49.1
小鼠肠悬液Mice intestinal elution	表达SA11 VP4的重组腺病毒Adenovirus expressing SA11 VP4	1:8	0.430	0.218	49.3
小鼠粪便悬液Mice fecal elution	表达SA11 VP4的重组腺病毒Adenovirus expressing SA11 VP4	1:2	1.058	0.468	55.8
小鼠阴性血清Mice negative serum	免疫前Before immunization	1:4	0.233	0.240	－
小鼠阴性血清Mice negative serum	腺病毒载体Adenoviral vecto r	1:4	0.343	0.312	9.0
小鼠阴性肠悬液 Intestinal elution from control mice	PBS	1:4	0.050	0.048	4.0
小鼠阴性粪便悬液Fecal elution from control mice	PBS	1:4	0.065	0.060	7.7