面筋蛋白酶解物调节肉鸡免疫器官及ND抗体水平的研究

摘要:选用160只雄性AA肉鸡，随机分为对照组，试验1组，2组和3组，每组40只。试验组肌肉注射经氯化钠缓冲液洗涤法制备的面筋蛋白的弹性蛋白酶酶解物。对照组肌肉注射生理盐水，每隔7 d注射1次。结果显示，与对照组相比，试验2组的肉鸡血清新城疫病毒抗体滴度14日龄和21日龄分别显著性上升了1.3个和1.1个滴度（P<0.05）；试验1组和3组也有所提高，但差异不显著（P>0.05）。试验2组胸腺比对照组提高了26.4%（P<0.05）；各试验组的GH浓度都比对照组高（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；试验2组T₃水平比对照组高18.7%（P<0.01）；各试验组的胰岛素、T₄水平与对照组差异不显著（P > 0.05）。结果表明肌肉注射弹性蛋白胃蛋白酶酶解物能够增强肉鸡免疫功能，并且这种作用与肉鸡内分泌的调理有较为密切的联系，其中以弹性蛋白酶水解面筋2 h的蛋白效果最佳。

弹性蛋白酶（elastase）对弹性蛋白（elastin）这种难以被普通蛋白酶所降解的硬蛋白有极强的蛋白水解活性^[1]，该酶还对酪蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、面筋蛋白等多种蛋白质具有水解活性^[2]，故弹性蛋白酶是一种以降解弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶^[3]。

早在20世纪80年代就有研究发现，一些蛋白经蛋白酶降解后产生的小肽能被动物胃肠道完整地吸收。以小肽形式供给蛋白质，可显著提高动物对蛋白质的利用率，并且能够调节动物体消化、内分泌和免疫等系统的生理活动。随着小肽吸收理论越来越广泛的被人们接受，活性短肽在动物蛋白质营养中的作用愈发受到关注，因而利用生物活性肽作为饲料添加剂调控动物的生理活动，提高畜禽生产性能和效益，具有广阔前景^[4]。有关植物源蛋白酶解活性肽的研究，尤其是其活性物质对动物免疫功能影响的报道仍不多见。本研究给AA肉鸡肌肉注射面筋蛋白的弹性蛋白酶水解物，通过观察体液、细胞免疫和血清中几种激素水平，初步研究面筋蛋白酶解物对禽类免疫功能的影响及面筋蛋白水解物的生理功能，为其应用于畜牧生产提供一定的理论和实验依据。

选取1日龄雄性AA肉鸡160羽（购自江苏省海门京海岸肉鸡公司），编翅号，育雏7 d。8日龄开始实验，随机分为4组，对照组，试验1组，2组和3组，4笼/组，10羽/笼进行饲养。采用红外灯调温，自由摄食与饮水，持续光照。在10日龄时，每羽鸡同时进行新城疫疫苗免疫接种La Sota活疫苗，由扬州大学生物制品厂提供；禽流感疫苗（H5亚型，油乳剂灭活苗），由农业部动物检疫所提供。

面筋蛋白，由市场上购买，弹性蛋白酶（Sigma公司产品），生长激素、胰岛素、T₃和T₄放射免疫试剂盒（北京北方所产品）。

根据文献[5]的方法略加改进。取面筋蛋白，按蛋白底物与弹性蛋白酶40∶1 的比例（m/m）加入弹性蛋白酶，在pH 7.0，36 ℃条件下，水解1.5，2.0，2.5 h，离心，取上清液保存备用。

各组饲喂正常基础日粮，对照组和试验1组，2组和3组分别于14日龄、21日龄和28日龄上午8：00肌肉注射生理盐水和面筋蛋白水解1.5，2.0 h和2.5 h的水解液，剂量均为1 mL/kg体重。试验第42天屠宰并采血，分离血清，-20 ℃保存备用，同时摘取胸腺、脾脏和法氏囊称重。全价饲料由南京禾嘉牧业饲料公司提供，为玉米豆粕型日粮，原料组成及营养标准见表1。

注：*每千克日粮添加铜8 mg，铁80 mg，锰100 mg，碘0.35 mg，硒0.25 mg，钴0.4 mg，维生素A 8 800 IU，维生素D₃ 3 000 IU，维生素E 30 mg，维生素K₃ 1.6 mg，硫胺素6.6 mg，核黄素6.6 mg，吡哆醇4.4 mg，维生素B₁₂ 0.02 mg，泛酸11 mg，烟酸66 mg，叶酸1 mg，生物素0.2 mg。

Note:*Cu 8 mg，Fe 80 mg，Mn 100 mg，10.35 mg，Se 0.25mg，Co 0.4 mg，VA 8 800 IU，VD₃ 3 000 IU，VE30 mg，VK₃1.6 mg，VB₁6.6 mg，VB₂6.6 mg，VB₆ 4.4 mg，VB₁₂0.02 mg，VB₃11 mg，Vpp 66 mg，Folic acid 1 mg，VH 0.2 mg per kg diet.

1.4.1 免疫力测定血凝抑制试验（HI）测定鸡血清ND抗体滴度，采用β微量法^[10]进行，ND标准抗原为疫苗毒株（克隆30+克隆N₈₈），由扬州大学生物制品厂提供，10 mL/L鸡红细胞按常规方法制备。滴度以log2的平均值表示。

1.4.2 免疫器官与免疫指数测定脾脏、胸腺、法氏囊在屠宰时一起摘取并称取鲜重，以器官重量与活体重的比值表示。

1.4.3 激素测定生长激素（growth hormone，GH）、胰岛素（insulin，Ins）、三碘甲腺原氨酸（thyro xine T₃）、四碘甲腺原氨酸（triiodothyronine T₄）的放射免疫检测试剂盒为北京北方所产品，由南京鼓楼医院完成测定工作。

所有数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS统计软件进行试验组与对照组比较显著性检验。

表2 不同水解时间的面筋蛋白水解液对AA肉鸡新城疫HI抗体效价的影响

Table 2 Effects of different time of gluten hydrolysates on ND HI titers in AA broilers

组别 Groups	日龄Day age
组别 Groups	14	21	28	35
对照组 Control group	5.2±0.3^a	5.0±0.2^a	4.2±0.4^a	3.3±0.2^a
试验1组 Experiment group 1	5.6±0.2^a	5.5±0.1^a	4.8±0.3^a	4.0±0.2^a
试验2组 Experiment group 2	6.5±0.3^b	6.1±0.2^b	5.0±0.1^a	4.0±0.3^a
试验3组 Experiment group 3	6.3±0.4^a	5.6±0.6^a	4.5±0.4^a	3.5±0.3^a

注：列中相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Note:Means with the same letters were not significantly different，and the different small letters represent significant difference(P< 0.05).

从表2可以看出，在7日龄接种ND疫苗后，对照组HI抗体效价14日龄达峰值，以后逐渐下降；3个试验组HI抗体效价变化趋势与对照组相似，但试验2组在14日龄和21日龄的HI抗体效价显著高于对照组1.4和1.1滴度（P<0.05）；试验1组和3组的HI抗体效价高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。表明面筋蛋白水解物能显著提高肉鸡血清ND抗体的HI抗体效价，其中酶解2 h的水解物对ND疫苗免疫效果有显著增强作用。

2.2 肌肉注射面筋蛋白水解液对AA肉鸡免疫器官重量和指数的影响

表3 不同水解时间的面筋蛋白水解液对肉鸡免疫器官的相对重量及指数的影响

Table 3 Effects of different time of gluten hydrolysates on the immunity organs and immunity organ index in AA broiler

组别 Groups	活重/kg Body weight	脾重/g Spleen weight	脾脏指数×10^-3 Spleen index	胸腺重/gThymus weight	胸腺指数×10^-3 Thymus index	法氏囊重/g Bursa weight	法氏囊指数 ×10^-3 Bursa index
对照组 Control group	1.91±0.03^a	2.03±0.31^a	1.06±0.09^a	8.48±0.05^a	4.44±0.32^a	2.73±0.31^a	1.43±0.38^a
试验1组 Experiment group1	2.24±0.03^a	2.68±0.22^a	1.19±0.08^a	9.59±0.11^a	4.28±0.011^a	3.47±0.58^a	1.55±0.20^a
试验2组 Experiment group 2	2.52±0.04^a	2.91±0.24^a	1.15±0.016^a	10.72±0.08^b	4.25±0.021^a	3.81±0.22^a	1.51±0.39^a
试验3组 Experiment group 3	2.32±0.13^a	2.26±0.34^a	0.97±0.05^a	9.53±0.09^a	4.11±0.017^a	2.79±0.29^a	1.20±0.24^a

注：列中相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Note:Means with the same letters were not significantly different,and the different small letters represent significant difference(P< 0.05).

从表3可见，试验组的脾重、胸腺重、法氏囊重都比对照组不同程度的提高，其中试验2组的胸腺显著性的比对照组提高了26.4%（P<0.05）；各试验组的脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数无论是比对照组提高还是降低，差异均不显著（P>0.05）。结果提示面筋蛋白的弹性蛋白酶水解物与免疫存在一定的关系。

表4 不同水解时间的面筋蛋白水解液对AA肉鸡血清GH、Ins、T₃、T₄的影响

Table 4 Effecsts of different time of gluten hydralysates on serum hormone concentration in AA broilers

原料组成/% Ingredient	1日龄~21日龄 1 day old ~21day old	22~42日龄 22~42day old	营养水平^** Nutrient level	1~21日龄 1~21day old	22~42日龄 22~42day old
玉米Corn	60.11	66.41	代谢能（ME/mc/kg）	2.9442	3.0567
豆粕Soybean meal	29.82	24.00	粗蛋白（%）CP/	21.9164	19.0664
鱼粉Fish meal	3.90	2.90	钙（%）Ca	1.0036	0.8602
植物油 plant oil	2.05	2.90	有效磷（%）Available P	0.4942	0.4366
石粉Limestone meal	1.15	1.00	赖氨酸（%）Lys	1.1858	0.9852
磷酸氢钙CaHPO4	1.45	1.30	蛋氨酸（%）Met	0.5575	0.4897
食盐Salt	0.30	0.30	蛋+胱（%）Met + Cys	0.8746	0.7799
蛋氨酸Met	0.22	0.19	亚油酸（%）linoleic acid	1.8495	2.1312
预混料^*Premix	1.00	1.00	食盐（%）Salt	0.4500	0.4100

组别Groups	GH/（ng·mL^－1）	Ins/（μU·mL^－1）	T₃/（ng·mL^－1）	T₄/（ng·mL^－1）
对照组Control group	0.961±0.045^aA