畜产品中青霉素类药物残留检测方法研究进展*
陆 彦，吴国娟
（北京农学院动物科技系，北京
02206）
摘 要：药物残留危害着消费者健康。随着人民生活水平的提高，近年来畜产品中药物残留问题日益受到重视。青霉素类药物残留的分析方法主要包括高效液相色谱法、免疫分析法和微生物测定法，其中高效液相色谱法灵敏、高效，但需要特殊的检测仪器；微生物测定法简便，但灵敏度不高；免疫分析法是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种简便、快速、敏感的分析方法，目前虽刚起步但具有广阔的应用前景。
关键词：青霉素；残留；检测方法
青霉素类抗生素价格低廉，使用方便，抗菌作用强，是最常用的抗生素类。青霉素类的大量使用导致其残留是许多动物源食品的安全隐患[1]。为了避免消费者受到抗生素残留的危害，各国都有相应法规制定各种抗生素最高残留量(maximum residue limit, MRL)的标准[2-3]。在美国政府部门，牛奶中青霉素类抗生素的残留控制很严格，规定所有牛奶必须检测其中青霉素类抗生素的残留。青霉素G，阿莫西林、氨苄青霉素和邻氯青霉素的MRL分别为5，10，10 ng/mL和10 ng/mL。欧盟规定青霉素类抗生素在牛奶中的MRL标准，其中青霉素G、阿莫西林和氨苄青霉素为4 μg/L，苯甲异唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素为30 μg/L。中国农业部制定的氨苄青霉素在牛奶中的MRL为4 μg/L。下面就畜产品中青霉素类药物残留的检测方法做一综述。
1 微生物法
微生物法是抗生素残留检测的传统方法，测定原理是根据抗生素对微生物生理机能、代谢等抑制作用，来定性或定量检测样品中抗微生物药物残留，如纸片法(paper disc,PD)和试纸法等。微生物法样品处理简便，回收率高，不需要特殊设备。用嗜热脂肪芽孢杆菌检测青霉素在组织中的残留具有灵敏度高、培养时间短的特点，适用于兽药残留的定量和定性分析，是许多国家和地区检测青霉素的重要方法。王大菊等[4]用藤黄八叠球菌为指示剂，用杯碟法检测猪、鸡组织中氨苄青霉素的残留其最低检测限可达0.00025 μg/mL，标准曲线的工作范围为0.00125 μg/mL～0.02 μg/mL。变异系数为2.91％±0.2%，不同浓度氨苄青霉素的回收率在83%～107%。吴瑕等[5]采用试管扩散法检测牛乳中青霉素G残留量，检测过程可在4 h内完成,检测限是4 μg/kg。微生物法易受组织中其他抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便，样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。
2 仪器分析法
2.1 高效液相色谱法
由于青霉素类药物在结构上都含有羧酸基团，故早期采用离子交换色谱（一般选用阴离子交换柱）来测定这类抗菌药物。近年来多采用反向色谱法。其中最常用的检测方法就是用浓度类型的紫外检测器和荧光检测器。由于多数青霉素化合物没有专一的紫外发色基团，其最大吸收一般在200 nm～235 nm。在这段波长范围内，选择性一般都很差。当分析组织提取液中痕量青霉素时，背景的干扰往往很严重。因此测定食品中青霉素类药物残留都使用柱前或柱后衍生化技术，通过柱前衍生化反应可以有效地提高紫外检测器检测青霉素类药物残留的灵敏度。
（1）柱前衍生化紫外检测器测定。测定母体青霉素通常是在C18柱上分离后，用紫外检测器测定。为克服测定母体青霉素干扰问题，人们开发出衍生化青霉素的方法。Boison(1992)建立的测定形成青霉烷酸硫醇汞衍生物的方法，最大测定波长为325 nm，在该波长下很少有共生组分干扰测定，对β-内酰胺环的化合物具有专一性，但对不能形成硫醇汞衍生物的青霉素不能测定。利用上述原理，Verdon(1999)使用离子对反相高效液相色谱柱前衍生法测定了牛奶中苯唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素的残留，检测限可达2 μg/L。潘洪斌等[6]采用反相高效液相色谱法测定血浆中青霉素浓度，检测线性范围为0.05 μg/L～20 μg/L，最低检出浓度为0.05μg/L，回收率在95%～104%范围内。
（2）柱前衍生化后荧光检测器测定。由于其固有的高灵敏度，荧光检测法在多数液相色谱(liquid chromatography, LC)分析中优于紫外检测法。由于母体β-内酰胺没有荧光发色基团，因此必须采用衍生化使它产生荧光发色基团。有报道用OPA-巯基乙醇作为衍生化试剂，测定了青霉素类药物。也有人利用氨苄青霉素在甲醛和三氯乙酸溶液中形成能产生荧光衍生物的原理，用荧光检测器，测定牛奶中氨苄青霉素残留量，灵敏度可达1 μg/L。罗道栩等[7]用三氯乙酸溶液沉淀牛奶蛋白并提取氨苄青霉素残留,在酸性条件下,提取液中氨苄青霉素与甲醛加热生成2-羟基-3苯基-6-甲基吡嗪(氨苄青霉素荧光衍生物)，用带有荧光检测器的高效液相色谱仪在激发波长346 nm和发射波长420 nm条件下测定该衍生物，外标法定量。最低检测限为1 μg/L，最低定量限为2 μg/L，回收率为70%～110%，批内变异系数在10%以内，批间变异系数小于15%，阿莫西林也能发生这种衍生反应。此外还有用9芴基甲基氯甲酸酯和4-溴甲基-7-甲氧香豆素作为衍生化试剂的报道，但由于受到多种因素的限制，应用并不多。
（3）柱后衍生化反应。与柱前衍生化不同，柱后反应需要特殊的泵（把衍生化试剂加到经色谱柱分离后的流动相中）、反应芯、T型混合器、脱色机、混合室和蠕动泵等。用次氯酸或氢氧化钠使分离后的青霉素降解，然后用质子化的青霉素与氯化汞和EDTA反应。降解后的青霉素及其代谢物在波长>300 nm进行检测，通常情况下血浆检测限是25 μg/L，尿是200 μg/L。
2.2 色/质联用测定法
质谱(mass spectrometry,MS)作为一种专一型检测器分析青霉素类药物已获得广泛应用。其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、气相色谱质谱联用法(gas chromatographymass spectrometry,GCMS)、液相色谱质谱联用法(liquid chromatographymass spectrometry, LC-MS)和毛细管区带电泳质谱联用法(capillary zone electrophoresismass spectrometry,CZE-MS)等。使用电子轰击离子化、化学电离、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学电离和电喷雾电离技术对不同MS离子源条件下青霉素类分子碎片类型的特征已作了大量的研究工作。离子肼质谱技术也已用于鉴别β-内酰胺类抗生素。
2.3 气相色谱法
气相色谱法（gas chromatography, GC）测定动物组织中氨苄青霉素的残留，其样品前处理包括提取、甲基化和净化3个步骤。采用进样口程序升温的方式，可以提高青霉素测定的灵敏度和再现性。这种方法可以与MS技术结合，对青霉素进行定性鉴别。但是这种方法前处理过程复杂，回收率只有41%～98%，检测限<3 μg/kg。
2.4 薄层色谱法
动物组织中残留的氨苄青霉素、苄青霉素和苯甲氧基青霉素都可用薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)法分析。固定相主要是硅胶或纤维素。除Depaolis等(1999)使用自动射线照相色谱检测闪烁计数器定量外，其他的TLC方法都使用生物抑制法进行检测和定量。这种技术缺点是复杂，操作费用高，时间长，而且灵敏度低，检测限量通常为50 μg/kg。
3 免疫分析法
免疫分析（immunoassay, IAs）法是以抗原与抗体的特异性可逆性结合反应为基础的分析技术。非常适合于复杂基质中痕量组分的分离或检测，而且IAs技术作为兽药残留分析的检测手段能使分析过程，特别是前处理步骤大大简化，可以作为相对独立的快速检测方法。青霉素类药物属于小分子物质，不能刺激机体产生抗体，需要与载体蛋白结合作为免疫原免疫动物，动物体内可产生相应特异性的抗氨苄青霉素和载体蛋白的抗体，再用另一种载体蛋白与氨苄青霉素的连接物作为包被原筛选抗体，就可以得到针对青霉素类药物的特异性抗体。在此基础上建立酶联免疫检测方法测定青霉素类药物的残留。Usleber等(1998)用戊二醛法将氨苄青霉素侧链的氨基与蛋白质连接制备免疫半抗原，结合物突出了青霉素类药物的母核结构6APA。陆彦等[8]用碳化二亚胺法将氨苄青霉素载体蛋白偶联合成抗原，偶联物突出了氨苄青霉素的特异性基团，免疫小鼠后制备出抗氨苄青霉素的单克隆抗体。王琳等[9]采用碳化二亚胺法制备出抗邻氯青霉素的单克隆抗体。
与常规理化分析技术相比，IAs具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、容量大、成本低、安全可靠等优点。IAs取样量少、前处理简单、仪器化程度低，分析效率约为LC或GC的几十倍。
3.1 酶免疫测定法
酶免疫测定法使用酶进行标记，避免了同位素标记的放射性污染和标记物的稳定性问题，操作方便，仪器简单。在兽药残留仪器分析中应用最广泛的是酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA），目前已有许多用于兽药残留检测的商品化ELISA试剂盒。陆彦等[10]已有采用间接ELISA检测方法对牛奶中氨苄青霉素残留进行了检测报道，灵敏度达0.4 ng/mL。Samsonova Zh V等[11]采用间接免疫法测定牛奶中氨苄青霉素的含量，检测范围10 ng/mL~1 000 ng/mL，检测限5.0 ng/mL。
3.2 荧光免疫测定法
荧光免疫测定法（fluoroimmunoassay, FIA）仅次于酶免疫测定法的非同位素IAs，使用普通光激发荧光物质的FIA，由于易收背景干扰等原因，限制了FIA的灵敏度。近年来发展了一些方法如荧光偏振免疫测定法、荧光淬灭免疫测定法和时间分辨荧光免疫测定法，大大提高了FIA的灵敏度。使FIA在环境监测、医学和药物残留方面的应用得到进一步发展。BenitoPena E等[12]建立了荧光免疫测定β-内酰胺类抗生素残留的方法，对青霉素的检测限为2.4 ng/mL，回收率为99%~105%。
3.3 胶体金免疫测定法
胶体金免疫测定法是在免疫渗滤的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集在层析材料的一定区域，通过酶反应或直接可目测的标记物（如胶体金）得到直接的实验现象。这种方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简便快速，分析结果准确而且易于判定，特别适用于残留监控中现场的快速筛选监测分析[13-14]。
3.4 免疫传感器
免疫传感器是生物传感器的一种，传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号（如光、热、声、质量、颜色、电化学等）的变化，这些变化通过不同原理的传感器（如光敏管、压电装置、光极、热敏电阻、离子选择性电极等）转换成第二信号，经放大后显示或记录。利用青霉素类药物与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，可用于相应青霉素类药物残留进行快速定量定性检测[15-16]。Knecht B G等[17]利用免疫传感器对青霉素进行测定，在牛奶中检测青霉素残留过程不到5 min，检测范围在0.12 mg/L~32 mg/L。
免疫传感器的最大特点是便携性，其高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外进行快速筛选检测。
4 结语
青霉素类药物是治疗奶牛和其他食用动物疾病的常用药物之一。残留在动物性食品中的青霉素类药物会对人体、环境或农业生产造成巨大的危害。迫切需要开发快速、廉价、易于操作的免疫检测方法对其进行检测。目前，国外有许多关于研制青霉素类抗生素抗体的报道大多是单克隆抗体。而我国关于研制青霉素类抗生素抗体的报道很少，因此，青霉素类药物单克隆抗体的制备以及ELISA检测方法的建立既有理论意义又有实际意义。
参考文献（略）