禽类多能性干细胞研究进展

摘要：胚胎干细胞是未分化的具有增殖和自我更新能力的细胞，并且能分化成所有类型的体细胞以及生殖细胞。它们提供了早期胚胎分化的体外模型，也是基因操作的重要靶细胞。禽类多能性干细胞培养最重要的应用领域是以干细胞体外遗传修饰、鉴定为技术平台的家禽转基因技术。通过此技术对禽类基因进行遗传修饰与操作, 在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产及家禽育种等方面有巨大的应用前景。但是禽类多能性干细胞培养的许多基本问题仍亟待解决，如探索其建系的培养条件、揭示其维持多能性和增殖能力的分子机制等。文章综述了禽类多能性干细胞分离方法、体外分化能力、嵌合体形成以及基因修饰方面的研究进展及目前的研究局限。

胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）在鼠的早期胚胎发育研究中具有非常重要的价值，它不仅可作为同源重组的靶细胞生产转基因动物，而且可作为体外模型研究胚胎分化后不同细胞特征以及不同基因在分化中的作用。但是，真正的胚胎干细胞是能分化成所有体细胞类型的干细胞只能从小鼠囊胚中分离得到，原因是其他物种难于分离或者难以鉴定其全能性。尽管如此，多能性的类ESC相继被分离培养成功，包括猴^[1]，貂^[2]，大鼠^[3]，猪^[4]，鸡^[5]和斑马鱼^[6]等，但其中只有鸡ESC能够产生生殖系转移^[7-9]。这些结果为家禽胚胎干细胞的体外遗传操作和嵌合体制作为平台的家禽转基因技术提供了新的思路和可能。在最近15年中，鼠基因敲除以及其后续的操作已相当成熟，而禽类的相关研究仍处于早期阶段^[10-11]。

从体外培养的小鼠囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）获得的多能性干细胞系，称为胚胎干细胞，体外培养时可保持不分化并可在移植后形成畸胎瘤，可体外诱导分化形成胚体，当注入受体囊胚时可生长为包括生殖系在内的所有的组织类型。由于禽类胚胎特殊的发育特点，产下的新鲜卵中已经含有30 000个～60 000个细胞，因此无法像哺乳动物一样从ICM 中分离ES 细胞。1990年，Petitte J N等^[12]通过试验证明，从鸡新产卵中所分离的细胞注入相同发育时期的受体鸡胚中能够形成嵌合体，并且部分嵌合体为种系嵌合。因此，由发育到第Ⅹ期胚盘获得的禽类多能性干细胞称为禽类胚胎干细胞。

这一类多能性干细胞来源于迁移后的原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC），它是从10.5 dpc～11.5 dpc的小鼠胚胎分离的，在饲养层、白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor， LIF)、成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth fact-2, FGF-2)和干细胞因子(stem cell factor, SCF)同时存在时培养获得。像ESC一样，PGC来源的干细胞系也可以在体外分化并且在注入囊胚后得到体细胞和生殖系嵌合体。后来PGC来源的干细胞系被称为生殖干细胞（embryonic germ cell, EGC）以与来源于囊胚的ESC相区别。然而，EGC发育上形成的不正常基因印记会导致嵌合体的不正常发育。

小鼠ESC对于过去20年的研究产生了巨大的影响。因为ESC注射到囊胚可形成体细胞和生殖系嵌合体，就可作为同源重组靶细胞建立小鼠基因操作的基本平台，为发育过程和成体动物的基因功能研究提供了有力的工具。小鼠的ESC也可用于特定发育过程的体外研究及检测细胞分化时的分子成分。正是由于ESC在小鼠的应用推动了对家禽多能性胚胎干细胞的研究。许多国家相关的研究小组都在禽多能性胚胎干细胞体外长期传代和嵌合体生成甚至转基因技术上取得进展。

（1）从第Ⅹ期胚胎的胚盘分离ESC。Etches R J等^[14]对比了3种方法：①完整移植X期胚盘；②把胚盘细胞分散成单层后移植；③把分散的细胞培养在鼠成纤维细胞饲养层上48 h后移植。这3种方法都得到了体细胞嵌合体。方法3的体细胞嵌合率高于方法1和方法2，方法2和方法3在生殖系嵌合率上是相同的，不受培养状况的影响，但与未培养细胞相比生殖系转移率显著降低。Du L X A等^[15]在2003年也报道了同样的短期培养胚盘细胞的结果。由此可知优化的体外培养条件是获得干细胞的关键。

Pain B等^[5]取鸡的Ⅸ期～Ⅺ期和鹌鹑Ⅹ期～Ⅺ期胚盘细胞探索禽类多能性胚胎干细胞体外长期培养的条件。当单独使用生长因子进行培养时，鸡与鹌鹑的碱性磷酸酶阳性细胞无明显增加。然而，当联合应用hLIF (1 %V/V) ，bFGF(10 ng/ mL)和mSCF (10 ng/ mL) 添加到培养基时，碱性磷酸酶阳性细胞数量显著升高。将鼠源SCF 换为鸡源SCF (1%V/V) 可以在此基础上进一步提高阳性细胞克隆的数量。像小鼠ESC培养一样，LIF对于细胞长期增殖和存活是非常关键的。且LIF的存在支持几种胚胎干细胞相关标记蛋白的表达，如胚胎阶段表面特异性抗原1 (stage-specific embryonic antigens 1,SSEA-1)，上皮膜抗原EMA-1（epithelial membrane antigen 1,EMA-1）和上皮膜抗原EMA-7（epithelial membrane antigen 7,EMA-7）。当禽类ESC传多代后仍保持端粒酶活性，但以视黄酸刺激分化后即降低。

Petitte J N等^[16]检测了异种和同种饲养层及不同条件下鸟类胚胎干细胞的培养。把鸡Ⅹ期胚盘细胞分散后培养在STO细胞株饲养层、原始鸡胚成纤维细胞（chicken embryonic fibroblasts, CEF）饲养层或来自大鼠肝实质细胞（buffalo rat liver cell, BRL）的条件培养液及一种鸡源的肝脏肿瘤细胞系（a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH）条件培养液上。这些条件都不能单独支持胚盘细胞传至第2代。当CEF饲养层与LMH细胞条件培养液同时存在时，细胞很快分化为原始成纤维细胞。相反，STO饲养层结合BRL条件培养液可支持鸡胚盘细胞传至20代以上。Pain B等^[5]在1996年也观察到同样的结果。这样培养的鸡ES样细胞表达SSEA-1和EMA-1抗原，当以视黄酸诱导分化后，这些抗原也失去，所以从Ⅹ期胚盘来的细胞培养5代后，表现胚胎干细胞样表型是可能的。

（2）分离和培养EGC。禽类的PGC在原肠胚形成期经过相当复杂的迁移，由生殖新月部位到达生殖嵴，此时孵化72 h～96 h。在这一过程中，从ⅩⅤ期胚胎血液或更大胚胎的未分化性腺中可产生部分PGC。Park T S等^[17]分离未分化性腺中的PGC并培养了4个月。首先是分散28期性腺，其中含有基质细胞和生殖细胞，培养在SCF，LIF，FGF-2，IL-Ⅱ和胰岛素样生长因子（insulin growth factor, IGF-1）存在的培养液中，在此条件下，基质细胞形成饲养层支持生殖细胞生长成集落。7 d后，离散的生殖细胞集落转移到未用丝裂霉素失活的鸡胚饲养层上，可生长4个月。不像禽类ESC或鼠的EGC，鸡EGC并不黏附到饲养层也不可用丝裂霉素失活的STO细胞或原始CEF支持。后者的原因仍然不得而知。这些细胞也表达SSEA-1，并且使Schiff酸反应呈阳性，表明为PGC。

多能性干细胞的一个特征是具有体外分化为多种细胞的能力。Pain B等^[5]在1996年报道禽类ESC经视黄酸诱导分化，悬浮培养时可形成胚体，可自发分化为神经细胞、红血细胞和肌细胞。Park T S等^[17]报道失去饲养层和LIF后鸡EGC形成简单胚体。Petitte J N等^[16]检测了鸡EGC移植到9 d鸡胚绒毛尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane,CAM）上的分化能力，体外培养的ESC和完整Ⅹ期鸡胚都发育成畸胎瘤样结构，趋向形成有结构的组织，出现从CAM到肿瘤的血管，并可观察到造血区、大小不一的上皮细胞内腔、被软骨样结构包被的细胞及大量角质化细胞分布在移植物表面。

虽然Ⅹ期胚盘来源的类ESC表达多能性相关的标记，但最确切的发育潜能鉴定标志是形成体细胞和生殖系嵌合体。禽类胚胎在卵壳中离体发育，因此可方便的用于制作体细胞嵌合体。然而要应用禽类胚胎干细胞系进行基因组操作，必需像小鼠的囊胚注射一样运用可靠的方法得到生殖系嵌合体。Petitte J N等^[12]试验证明，新生鸡卵胚盘细胞形成嵌合体的关键步骤是用亚致死剂量的γ射线照射受体胚或者去掉其明区的细胞使其接受移植细胞，这两项技术可保证嵌合体的高效形成。Pain B等^[5]在1996年报道培养第1代至第3代的胚盘细胞可产生体细胞嵌合体。用羽色作为嵌合标记，把培养7 d的细胞注入受体胚胎中得到2只生殖系嵌合鸡。Park T S等^[17]把白羽鸡第4代EGC注射到黑色鸡时产生羽色嵌合鸡。PCR检测到嵌合鸡的心、肝、肌肉和性腺中供体鸡特异性DNA。表明培养细胞在嵌合体内形成了多种细胞类型。随后，Park T S等^[18]把白羽鸡带荧光标记的EGC注射入ⅩⅤⅡ期黑羽鸡胚胎的背大动脉。孵化5.5 d后的嵌合体鸡性腺中可找到荧光标记的第2代EGC。接下来进行孵化鸡的侧交显示培养细胞生长为有功能的生殖细胞。显然体外培养的EGC的功能更近似于PGC，可能只产生生殖系，因为用培养5 d的PGC得到了同样的结果。Petitte J N等^[16]发现ESC毛色嵌合水平和生殖系转移的频率都随着代数增加而降低。只有早期传代的细胞可以形成生殖系嵌合，用这种细胞生产转基因禽类时保持最优培养条是以支持多能性的关键。

对ESC应用的重要途径是用基因工程改变其基因组以生产转基因动物，而如何转染多能性干细胞是应用禽类干细胞技术的重要内容。用脂质体转移、电转移或通过病毒载体都可转染新鲜的胚盘细胞，但是除了用病毒载体外，DNA整合的效率都很低以至于无法有效得到生殖系转移的细胞。用体外培养的多能性干细胞则可对整合了外源基因的细胞进行长期筛选，也可以通过同源重组定点改变基因。Pain B等^[19]用多种脂质体优化了鸟类ESC的转染条件。以最低血清浓度培养时，观察到分化细胞比未分化细胞更容易转染，虽然转染效率较低，但可以用新霉素选择未分化细胞。

最近，Van de Lavoir M C等^[8]第一次报道转染CX-GFP-Puro基因的ESC在体外培养了9个月并且获得高嵌合率的后代。这一成果是家禽干细胞基因修饰技术上的一大进步，但在基础研究上更重要的是阐明禽类ESC多能性维持的分子机制^[9,20-21]。在小鼠中，胚胎干细胞的多能性和自我更新看起来是通过3个转录因子（Oct-4，Stat3和Nanog）来维持。Oct-4和Nanog通过Stat3作用，激活 LIF/gp130信号，从而支持多能性。阐明禽类干细胞多能性的分子机理首先需要找到体外培养多能性禽类干细胞至高代次的可靠方法，但这正是目前欠缺的。尝试克隆鸟类的Oct-4没有成功，而禽类基因组测序结果的公开有利于了解鸟类多能性干细胞的基因特性及其与哺乳动物的区别^[22-23]。最近，Acloque H 等^[24]报道转录因子cCP2在控制鸡胚早期发育和胚胎干细胞多能性的维持上起到重要作用，揭示了cCP2可能是鸡的多能性干细胞的分子标记。

禽类ESC最重要的应用领域是以ESC的培养与体外遗传修饰、鉴定为技术平台的家禽转基因技术，可以在3个方面获得显著的社会效益与经济价值：①鸡的胚胎是研究脊椎动物早期发育的重要模型。最近鸡的基因组测序推动了对鸡和其他脊椎动物模型的比较遗传学；②用多能性干细胞对家禽进行定点遗传修饰可改变一些特殊位点,在禽肉中生产有益的动物蛋白；③母鸡在产蛋过程中是最有效的蛋白质合成器。这些特征吸引了制药商用它生产具有特殊治疗功能的经转录后修饰的蛋白质。然而禽类ESC和EGC形成的生殖系嵌合体的效率还是很低的，而且最好用早期传代的细胞。因此，禽类干细胞研究急需改进培养方法，并阐释其多能性的分子机制，随着这些问题的解决，对它们的应用潜力也必将提高。

＊收稿日期：2006-01-13

基金项目：广东省自然科学基金（5012371）

作者简介：陈志胜（1973-），女，湖南邵阳人，讲师，博士，主要从事干细胞生物学相关研究。