PCR及相关技术在鸡球虫种株鉴别方面的应用*

李文超¹，陶建平²，沈永林³，顾有方¹，陈会良¹，彭丽萍¹

(1.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095) 

摘　要：鸡球虫病是危害养禽业的重大疫病之一，其病原属于艾美耳属(Eimeria)的球虫，世界上公认有7种。过去，其病原的鉴别一直是研究的难点。近年来，由于分子生物学技术，尤其是PCR及其相关技术的迅猛发展及在寄生虫分类中的应用，鸡球虫种、株鉴别方法也由以形态特征和生活史等为标准的传统分类学进入了以核酸为材料的现代分子分类学时代。文章对PCR及其相关技术在鸡球虫种、株鉴别方面的应用做了较为全面的阐述，并分析了其优缺点。

关键词：球虫；聚合酶链式反应；鸡

鸡球虫病(Coccidiosis)是集约化养鸡场最常见的禽病之一。鸡球虫种的鉴别过去一直依赖于形态学、宿主及寄生部位特异性、潜在期、孢子化时间和致病性等指标，尽管这些鉴别指标迄今仍然用于鸡球虫病的流行病学等研究中，但因球虫受到遗传和环境的影响，有时不能做为鉴别虫种的可靠指标，更不能用于鉴别同一虫种的不同虫株。自1985年Mulls等创立聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术以来，它已成为分子生物学领域最常用的方法之一，并以此为基础发展出数种相关技术。

1　PCR技术

1.1　一般PCR

Schnitzler等根据7种鸡球虫rDNA的内转录间隔区1(internal trascribed space 1，ITS1)序列设计出了种特异性引物用于PCR反应，从对不同种或分离物的PCR扩增结果来看，DNA中扩增的阳性产物只有用特异引物才能得到，用别的引物没有观察到交叉扩增产物，这一结果与同工酶分析一致，而且PCR分析仅需约25个卵囊。随后，Schnitzler等又对这一方法进行了改进，并研制了商品化的试剂盒。

1.2　荧光 PCR

荧光PCR是荧光标记技术与PCR相结合的产物。Gasser R B等^[1]建立了一种基于荧光标记来鉴别鸡7种球虫的电泳方法，首先用荧光标记的种特异性引物经PCR扩增出球虫的内转录间隔区 2(internal trascribed space 2，ITS-2)DNA片段，然后将扩增子热变性并用DNA序列分析仪进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，D-PAGE)，产生的色层分离谱用电脑软件分析。尽管有2种球虫在色层分离谱上检测到某些变异(反映种群变异)，但用各已知种的DNA样品作对照，仍然可以限定每一种球虫在色层分离谱上的范围。该方法既适合卵囊样品大批量的诊断性筛选，也将是流行病学研究，球虫病检测和疫苗质量控制的有效工具。随后，Gasser R B等^[2]用一系列寡核苷酸引物(其中之一用荧光标记)扩增了7种鸡球虫TS-2序列，扩增产物经热变性后用毛细管电泳分析，获得的色谱图片用软件自动分析，可用于鸡球虫的种株鉴别。

1.3　多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)技术是设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，这些引物各自结合在靶DNA相应的部位，从而扩增出多个特异性的DNA片段的方法。其已被成功地应用到了生物学的多方面，如各类病原的检测与鉴别，遗传疾病诊断及基因缺失，突变和多态性分析等。Fernandez S等^[3]根据7种鸡球虫的特征性序列扩增区设计出了种特异性引物用于多重PCR，可同时检测和鉴别7种鸡球虫，产物的片段大小范围为200 bp～811 bp，最小检出量为1 pg～5 pg DNA，相当于2个～8个孢子化卵囊。不管样品中某一种球虫是否大量存在，所有种类都可同时被扩增，不会发生交叉干扰，而且用不同来源的Taq DNA酶和不同型号的扩增仪扩增，证实反应具有高度重复性，该法可用于鸡球虫种类的检测和鉴定。

多重PCR技术较常规PCR相比，可满足同时分析不同DNA序列的需要，节约试验样品和试剂，操作省时省力等优点。但其扩增条件严格，需优化反应条件，技术难度大。

1.4　随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)是由Williams等和Welsh等分别报道的一种新的DNA指纹技术。目前主要用于球虫种与株的鉴定，流行病学调查和抗药性研究等。

Macpherson等将RAPD技术应用于来自不同宿主的7种艾美耳球虫的虫种鉴定的研究，结果表明选择合适的引物可以鉴别7种艾美耳属球虫，有些引物扩增不同种球虫可产生共同谱带，提示该技术对研究虫种间相互关系也将是非常有用的。同年，Procunier等对鸡的6种艾美耳球虫，2株E. acervulina和2株E. tenella间的基因组DNA进行分析，结果显示用RAPD主带计算，种间的相似性系数(Similarity coefficients，SI)值小于30%，2株E.acervulina间的SI值为61%，而2株E. tenella间的SI值高达98%。Johston等用PAGE和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)分析了鸡球虫各虫种、株，发现虫种间的SI值分别为4%～38%和3%～18%，而E.acervulina虫株间的SI值分别为55%～95%和51%～85%。Shirley等应用该技术对7株/系E. tenella分析，41种随机引物中有24种(59%)能产生1个～20个大小不等的DNA片段，其中1 398 NB引物在7株E. tenella中都能扩增一条2 kb的大片段，用该片段作探针，发现其总是与用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gene electrophresis，PFGE)分离出的第12号染色体杂交，说明该扩增产物可作为E. tenella种的遗传标记，尽管从199条扩增片段中仅鉴别出4条特异性片段，但清楚地证明这些表型不同(如弱毒、早熟)的E. tenella各株间具有明显的种内变异和DNA多态性，这些变异片段可用于这些不同株/系的鉴别。Tsuji等扩增出8种鸡球虫的srRNA基因，然后用10条引物对srRNA基因进行扩增，发现有8条引物能产生有鉴别意义的条带，这一方法可以用于鸡球虫病流行病学的调查和球虫种类的鉴定。刘群等^[4]在分析了鸡的4种球虫及多个虫株间的RAPD多态性，认为RAPD技术可以用于同宿主艾美耳球虫虫种的分类鉴定，并且可作为球虫株间变异的分子标记方法及球虫株间关系距离的检测手段。Nowzari N等^[5]通过该技术对来自伊朗的E. tenella，E. acervulina和E.maxima的各5个分离物进行分析，认为该技术能够用于球虫种株鉴别，而且在流行病学调查和疫苗的设计方面也是很有用的。Costa C A等^[6]用RAPD分析3株E.acervulina，1株E. maxima，4株E. mitis，6株E. praecox，1株E. tenella和2株不明分离物，显示一些引物是E. acervulina，E.mitis和E. praecox特异性的，表型揭示的6个集群分别对应一个艾美耳物种，种内关系显示艾美耳群内存在一定程度的分离，其与虫株来缘于不同的鸡场和地理区域有关。Fernandez S等^[7]从150个引物中筛选出了11个能够区分7种鸡球虫的RAPD引物，并把25个种特异性的RAPD条带转换为SCAR Marker(sequence characterized amplified region Marker)，最终产生了14个能够用于7种鸡球虫分子诊断的种特异性SCAR Marker。Fernandez S等^[8]报道了区分7种鸡球虫的151个SCAR Marker的发展和特性情况，并由此在互联网上建立了一个相关数据库，用于鸡球虫的分子诊断，流行病学，遗传多态性和基因图谱研究。

1.5　扩增片段长度多态性

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是由Zabeau等发明的一种DNA指纹技术，其通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。Shirley M W等^[9]用AFLP，RAPD和RFLP技术作出了E.tenella的遗传连锁图谱，其中用AFLP得到的超过8 600条的谱带中，筛选出了379条多态性DNA标记。由于该技术需要较大量的DNA(0.2 mg～1 mg)，故AFLP在球虫的研究中受到一定的限制。Blake D P等^[10]通过用该技术分析E.maxima时发展了一种把所需卵囊从2×10⁸降到≤1×10⁶的方法，该方法可望用于球虫遗传分析的研究。

AFLP技术实际上是将RFLP和PCR相结合的一种技术。该技术既继承了RFLP的稳定性，又具有PCR反应快速、灵敏的特点，同时克服了RFLP和RAPD的缺点，且扩增的带纹多(50条～100条)，而且AFLP的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应，试验重复性高，该标记为孟德尔式遗传。但该技术存在着对模板反应迟钝，谱带可能发生错配与缺失，成本较高，对技术要求苛刻等限制。

1.6　聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性

聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)是对RFLP的一种改进方法。与常规的RFLP相比，PCR-RFLP具有技术简便，快速，低成本，只需微量DNA，对样品纯度要求不高等优点，而且也不需要用放射性标记探针做杂交，尤其适用于个体分析。

PCR-RFLP方法鉴别寄生虫必须选择具有显著差异的目的DNA区域。若要鉴别不同的种，则种间目的DNA区域必须存在显著差异，而在种内则变异越小越好；若要进行不同虫株的分型，则同种内目的DNA区域必须存在显著差异。目前，许多DNA区域，例如重复DNA(卫星DNA)、线粒体DNA(mtDNA)和核糖体DNA(rDNA)都被用于寄生虫的种或株的鉴定。在鸡球虫种、株的鉴定中，rDNA作为目的DNA区域已被广泛应用。

球虫与大多数真核生物一样，rRNA基因(即rDNA)是一种中度重复并具有转录活性的基因家族，其基本结构从核酸5′到3′依次为外转录间隔区(external trascribed space，ETS)，18 S rRNA基因，ITS1，5.8 S rRNA基因，ITS2和28 S rRNA基因。rDNA的18 S，5.8 S和28 S rRNA编码序列区高度保守，而NTS及ITS则高度变异，故间隔区序列为球虫的虫种鉴定提供了非常有价值的遗传标记。同样，球虫的5 S rRNA基因在基因组中以串联重复序列排列，其结构基因部分相当保守，但在两侧的倒翼序列突变频率甚高，在种间有明显差异。

Woods W G等^[11]以ITS-2为目的DNA区域，用该技术对来自澳大利亚的21个鸡球虫样品(3株E.acervulina，3株E.brunetti，3株E.maxima，4株E. necatrix，2株E. praecox和5株E. tenella)进行了分析，结果显示PCR扩增产物的分子大小为370 bp～620 bp，琼脂糖电泳显示异种球虫间扩增的条带数目和大小不同，但在同种不同株间差异不明显，扩增产物经纯化、酶切、放射性标记和变性后，进行变性凝胶电泳，发现电泳图谱具有种特异性，认为球虫的ITS-2 DNA区域含有能鉴别不同虫种的遗传标记。这与Hnida等的研究结果相符，后者对啮齿动物的10种艾美耳球虫的18 S rDNA进行了PCR-RFLP分析，结果表明核糖指纹(riboprinting)能够区分所有的虫种(E. sevilletensis与E. falciformis，以及E.arizonensis与E.albigulae间除外)，用距离法和简约系统法分析，显示E. albigulae，E. reedi，E. arizonensis，E. papillata和E.onychomysis属同一分支。

1.7　单链构象多态性

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism， SSCP)最初是由日本学者Orita等建立起来的一种简便、灵敏的基因突变检测方法。随后，Hayashi等将SSCP与PCR相结合，用SSCP来分析PCR扩增的DNA片段，因而被命名为PCR-SSCP。用PCR-SSCP技术来研究鸡球虫仅见于Woods W G等^[12]的报道，首先对5种鸡球虫的ITS-1和ITS-2 DNA片段进行扩增，然后将扩增产物进行D-PAGE和SSCP分析，结果显示ITS-1和ITS-2 DNA片段D-PAGE图谱上的差异能够鉴别5种鸡球虫，而SSCP能检出用D-PAGE方法不能检出的分离物间的群体变异。

1.8　PCR介导的DNA序列分析

DNA序列分析是研究生物遗传变异的一种高分辨力方法。目前，用于球虫研究的基因多数为rRNA基因，包括18 S rRNA基因，ITS1，5.8 S rRNA基因，ITS2，28 S rRNA基因和5 S rRNA基因。

Barta等根据真核生物的18 S rRNA基因3′和5′端的高度保守区序列设计了一对特异性引物，分别对8种鸡球虫和一种牛球虫的全基因组DNA进行了PCR扩增，并将扩增获得的各球虫的18 S基因进行了全序列分析和亲源关系比较，结果18 S基因的大小分别为E. acervulina 1 748 bp，E.brunetti 1 744 bp，E. maxima 1 750 bp，E. mitis 1 749 bp，E. mivati 1 750 bp，E. necatrix 1 756 bp，E. praecox  1 747 bp，E. tenella 1 756 bp和E. bovis 1 727 bp；在亲源关系上，E. necatrix和E. tenella是姊妹种，E. mitis和E.mivati是另一姊妹种，E. praecox，E. maxima和E. brunetti是亲源关系较近的另一个类群，而这几个姊妹种又与E. acervulina组成另一支序，同时把E. bovis，2个Sarcocystis spp，Toxoplasma gondii和Neospora caninum的序列进行比较，发现鸡的球虫与E. bovis的亲源关系较近。Barta等又对北美地区5株E. maxima的ITS-1，5.8 S rRNA和ITS-2基因进行了序列分析，结果表明株内变异主要发生在ITS区，5.8 S rRNA基因序列除Maryland株与其他4株有2个碱基改变外，其余均相同，但株间亲缘关系与交叉免疫保护力结果不相符。Su Y C等^[13]由GenBank公布的球虫rRNA基因序列设计了种特异性引物，分别对E. acervulina，E. brunetti，E. maxima，E. necatrix和E. tenella的疫苗株和E. tenella台湾株的ITS-1进行扩增，并对扩增产物进行序列分析和比较，结果显示E. acervulina的ITS-1分子大小为303 bp，E. brunetti为395 bp，E. maxima为151 bp，E. necatrix为385 bp和E. tenella为463 bp，序列与GenBank公布的相比，疫苗株的同源性为91%～99%，台湾株为99.6%，PCR的敏感性为50个卵囊，认为这5对引物可用于鸡球虫病的诊断。Lew A E等^[14]以rRNA基因的ITS-1区为目的片段，对澳大利亚15个样品中的22株鸡球虫的ITS-1进行了PCR扩增和测序，并用最大节约法，最大似然法和距离法对澳大利亚鸡球虫种、株间的亲缘关系进行了分析，结果显示一旦种和株间的遗传变异被确定，ITS-1就可作为种特异性分析的目标，但仅仅是ITS-1的序列不适宜用于这些球虫种间的系统发育分析。Lien Y Y等用ITS-2特异的引物进行PCR反应，成功地鉴别出了E. tenella，E. maxima和E. acervulina。PCR产物大小位于370 bp和580 bp之间，PCR产物克隆和测序结果显示3种球虫的核苷酸序列相似性在98.5%～99.3%，E. tenella的ITS-2序列与GenBank公布的相应序列同源性为98.5%～99.3%，比E. maxima与GenBank公布的相应序列的同源性81.6%～96.5%要高。

2　结语

与传统方法相比，尽管基于PCR技术的各种方法有许多优势，但目前还没有任何一种方法能满足作为理想的球虫分类的所有要求。上述列举的方法各有优缺点，有些在球虫分类应用中还存在争议，故在实际应用中应根据研究目的和实验条件等选择相应的技术。相信随着对球虫分子生物学的进一步的认识，特别是E. tenella基因组计划的实施，将大大地增加我们对球虫的理解和为未来对球虫的研究提供广阔的机遇，并最终获得控制球虫病的理想方法。

参考文献（略）